Een set van in situ geïnformeerde gesimuleerde mediumformaten voor het kweken van milieuvriendelijke anaërobe micro-organismen

De meeste micro-organismen blijven ongekweekt; Dit wordt ondersteund door de grote ongelijkheid tussen cellen die door microscopie wordt waargenomen, in tegenstelling tot de weinige micro-organismen die met succes zijn gekweekt met behulp van agarplaten. Staley en Konopka noemden deze ongelijkheid de “Great Plate Count Anomaly”¹. De geschatte niet-verantwoorde diversiteit wordt ondersteund door metagenomische en metatranscriptomische gegevens die veel nieuwe geslachten laten zien, verdeeld in rangovervloedscurven uit verschillende omgevingen². Micro-organismen die zijn waargenomen (meestal door willekeurige shotgun-sequencing van een microbiële gemeenschap) maar niet zijn gekweekt, worden “microbiële donkere materie” ^genoemd3,4.

In het tijdperk van -omics blijft het kweken van micro-organismen noodzakelijk om genomische gegevens volledig te evalueren en de functie/het fenotype van de aanwezige genen te verifiëren. Het sequencen van gekweekte micro-organismen is nog steeds de enige manier om met vertrouwen volledige genomen te verkrijgen totdat technologieën zoals shotgun-metagenomica en metagenoom-geassembleerde genomen uit de omgeving toelaatbaar onfeilbaar worden⁵. Genomische evaluaties in combinatie met gekweekte micro-organismen bieden sterke gevolgtrekkingen voor het begrijpen van ‘microbiële donkere materie’. Veel leden van de “microbiële donkere materie” vervullen cruciale functies die van invloed zijn op de kringloop van voedingsstoffen en andere elementen en de productie van waardevolle natuurlijke producten, ecologische systemen ondersteunen en ecologische diensten verlenen. Vanuit medisch oogpunt zijn ongeveer de helft van alle momenteel op de markt gebrachte geneesmiddelen producten en derivaten van producten van bacteriën, en het profileren van niet-gekweekte soorten wordt vermoed de antibiotica van de toekomst te onthullen. Om toegang te krijgen tot deze onbeschaafde meerderheid, moet een verscheidenheid aan teeltmethoden worden uitgebreid⁶. Onder de leden van de “microbiële donkere materie” worden anaërobe oligotrofe micro-organismen grotendeels ondergerapporteerd en bevatten ze waarschijnlijk ecologisch en industrieel waardevolle biochemische routes⁷, waardoor ze belangrijke doelen van kweek zijn. Anaërobe oligotrofe micro-organismen zijn echter moeilijker te kweken dan hun aërobe en copiotage tegenhangers vanwege de vaak vereiste langere incubatietijden, veeleisende omstandigheden (bijv. bepaalde niet-standaard in-vitrotemperaturen ) en het gebruik van gespecialiseerde mediarecepten.

De huidige ontwikkelingstechnieken om leden van de “microbiële donkere materie” te kweken, waaronder nieuwe anaërobe oligotrofe micro-organismen, hebben ons begrip aanzienlijk verbeterd en de vertegenwoordiging van deze micro-organismen in de fylogenetische boom vergroot. De huidige technieken die gebruik maken van geïnformeerde media voor het kweken van nieuwe micro-organismen (d.w.z. media die zijn afgeleid met behulp van kennis van het (de) micro-organisme(n) van belang) kunnen worden onderverdeeld in drie verschillende methoden. De eerste van de methoden omvat de directe verwijdering van een discreet deel van de omgeving voor overdracht naar een in-vitrogroeikamer die al de micro-organismen van belang in een membraan bevat. Het discrete gedeelte (bijv. zeewater) fungeert om de micro-organismen van belang te voorzien van de geochemische habitat die ze in situ gebruiken, terwijl het membraan de beweging van cellen over de streep stopt (cellen van belang blijven binnen; vreemde cellen die met het discrete gedeelte zijn aangekomen, blijven zonder). Door verbindingen op te nemen die van nature beschikbaar zijn voor micro-organismen in hun natuurlijke habitat, kunnen dergelijke micro-organismen worden gekweekt⁸. De tweede methode maakt gebruik van metatranscriptomics of genomica om metabolische mogelijkheden op te helderen, waardoor aanwijzingen worden gegeven voor smalle kweekparameters voor een gericht mediumontwerp. Deze aanpak levert een ecofysiologisch profiel op dat kan worden gebruikt om de verrijking van specifieke soorten micro-organismen uit een omgeving te richten. De voorzieningen van het medium zijn afgestemd op de geïdentificeerde aanwezige genen waarvan wordt aangenomen dat ze het (de) beoogde micro-organisme(n) ondersteunen om de verrijkingsdiversiteit te ^{verminderen,9,10}. Een voorbehoud is dat genomische informatie niet direct de expressie van genen afleidt, terwijl transcriptomische informatie dat wel doet.

De derde methode omvat milieuvriendelijke en gesimuleerde media, die verschilt van de eerste methode, waarbij de media niet worden gesimuleerd, maar de omgeving rechtstreeks als mediabron wordt gebruikt. Deze derde methode vereist milieuverkenning van de geochemie van een veldlocatie die interessante micro-organismen bevat. Met deze kennis worden primaire componenten en fysische parameters geïdentificeerd om een milieuvriendelijk gesimuleerd medium te produceren. Het medium ontvangt vervolgens een directe infusie van micro-organisme-bevattend sediment of vloeistof uit de omgeving in het medium. Deze methode is met name van belang in gevallen waarin de kweekmicrobioloog geen toegang heeft tot voldoende hoeveelheden bronmilieu (zoals nodig voor de eerste methode) noch tot geschikte metatranscriptomische of genomische gegevens (zoals nodig voor de tweede).

Het volgende protocol is een voorbeeld van de derde methode; Het is geïnformeerd door en heeft tot doel interessante omgevingen te simuleren. Drie naïeve mediarecepten die gericht zijn op verschillende anaërobe micro-organismeculturen die in het veld zijn verworven, worden parallel gepresenteerd in het protocol. De drie vertegenwoordigde culturen zijn gemengde culturen afkomstig van de bodem (hierna “gemengde bodemcultuur”), gemengde culturen afkomstig van een boorgat (hierna “gemengde cultuur van boorgaten” genoemd) en een geïsoleerd methanogeen afkomstig van een boorgat (hierna “boorgatgeïsoleerd methaanogeen”). De samengestelde identiteiten en hoeveelheden in de mediarecepten die hier worden gedeeld, zijn bedoeld als een begingids; Ze kunnen en worden aangemoedigd om te worden aangepast aan de omgeving van de lezer en de micro-organismen die van belang zijn.