مجموعة من التنسيقات الوسيطة المحاكية المستنيرة في الموقع لزراعة الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية المكتسبة بيئيا
Summary
تركز هذه الورقة على تفصيل أفضل الممارسات لصنع الوسائط للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية الحساسة المكتسبة من البيئة. تساعد هذه الطرق في إدارة الثقافات اللاهوائية ويمكن تطبيقها لدعم نمو الكائنات الحية الدقيقة غير المستزرعة المراوغة ، “المادة المظلمة الميكروبية”.
Abstract
تعتمد الأبحاث المعتمدة على الثقافة للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية على الكفاءة المنهجية. يجب أن تخلق هذه الطرق وتحافظ على ظروف نمو مناسبة (على سبيل المثال ، الأس الهيدروجيني ومصادر الكربون) للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية مع السماح أيضا باستخراج العينات دون المساس بالبيئة الاصطناعية. وتحقيقا لهذه الغاية ، يمكن أن تكون الطرق التي تسترشد ببيئة في الموقع وتحاكيها ذات فائدة كبيرة في استزراع الكائنات الحية الدقيقة من تلك البيئة. هنا ، نحدد طريقة لاهوائية مستنيرة ومحاكاة في الموقع لزراعة الكائنات الحية الدقيقة الأرضية وتحت السطحية ، مع التركيز على جمع العينات اللاهوائية بأقل قدر من الاضطراب. يوضح هذا البروتوكول تفاصيل إنتاج وسط سائل لاهوائي قابل للتخصيص ، والاستحواذ البيئي والنمو في المختبر للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية. ويغطي البروتوكول أيضا المكونات الحاسمة لمفاعل حيوي لاهوائي يستخدم في المحاكاة البيئية للرواسب والوسائط السائلة اللاهوائية للمزارع المكتسبة بيئيا. لقد قمنا بتضمين بيانات تسلسل الجيل التالي الأولية من ميكروبيوم تمت صيانته على مدار عمر مفاعل حيوي حيث تم تعديل الثقافة النشطة ديناميكيا استجابة لمصدر تجريبي للكربون.
Introduction
معظم الكائنات الحية الدقيقة لا تزال غير مستزرعة. ويدعم ذلك التباين الكبير بين الخلايا التي لوحظت من خلال الفحص المجهري على النقيض من الكائنات الحية الدقيقة القليلة التي تم استزراعها بنجاح باستخدام ألواح أجار. أطلق ستالي وكونوبكا على هذا التفاوت اسم “شذوذ عدد الصفائح العظيم”1. يتم دعم التنوع المقدر غير المحسوب من خلال البيانات الميتاجينومية والميتاترانسكريبتومية التي تظهر العديد من الأجناس الجديدة الموزعة في منحنيات وفرة الرتبة من عدة بيئات مختلفة2. تمت الإشارة إلى الكائنات الحية الدقيقة التي لوحظت (بشكل عام عن طريق التسلسل العشوائي للبندقية لمجتمع ميكروبي) ولكن لم يتم استزراعها باسم “المادة المظلمة الميكروبية”3,4.
في عصر -omics ، يظل استزراع الكائنات الحية الدقيقة أمرا ضروريا لتقييم البيانات الجينومية بشكل كامل والتحقق من وظيفة / النمط الظاهري للجينات الموجودة. لا يزال تسلسل الكائنات الحية الدقيقة المستزرعة هو الطريقة الوحيدة للحصول بثقة على جينومات كاملة حتى تصبح تقنيات مثل metagenomics البندقية والجينومات المجمعة من metagenome من البيئة معصومة بشكل مقبول5. توفر التقييمات الجينومية إلى جانب الكائنات الحية الدقيقة المستزرعة استنتاجات قوية لفهم “المادة المظلمة الميكروبية”. يؤدي العديد من أعضاء “المادة المظلمة الميكروبية” وظائف حاسمة تؤثر على تدوير العناصر الغذائية والعناصر الأخرى وإنتاج المنتجات الطبيعية القيمة ، ودعم النظم البيئية ، وأداء الخدمات البيئية. من المنظور الطبي ، فإن حوالي نصف جميع المستحضرات الصيدلانية التي يتم تسويقها حاليا هي منتجات ومشتقات من منتجات من البكتيريا ، ويشتبه في أن تنميط الأنواع غير المستزرعة يكشف عن المضادات الحيوية في المستقبل. للوصول إلى هذه الأغلبية غير المثقفة ، يجب زيادة مجموعة متنوعة من منهجيات الزراعة6. من بين أعضاء “المادة المظلمة الميكروبية” ، لا يتم الإبلاغ عن الكائنات الحية الدقيقة قليلة التغذية اللاهوائية إلى حد كبير ومن المحتمل أن تحمل مسارات كيميائية حيوية ذات قيمة بيئيةوصناعية 7 ، مما يجعلها أهدافا مهمة للزراعة. ومع ذلك ، فإن الكائنات الحية الدقيقة قليلة التغذية اللاهوائية أكثر صعوبة في الاستزراع من نظيراتها الهوائية و copiotrophic بسبب أوقات الحضانة الأطول المطلوبة في كثير من الأحيان ، والظروف الصعبة (على سبيل المثال ، درجات حرارة معينة غير قياسية في المختبر ) ، واستخدام وصفات الوسائط المتخصصة.
التقنيات النامية الحالية لزرع أعضاء “المادة المظلمة الميكروبية” ، بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة قليلة التغذية اللاهوائية الجديدة ، قد حسنت بشكل كبير فهمنا وزادت من تمثيل هذه الكائنات الحية الدقيقة داخل شجرة التطور. يمكن فصل التقنيات الحالية التي تستخدم الوسائط المستنيرة لزراعة الكائنات الحية الدقيقة الجديدة (أي الوسائط المشتقة باستخدام معرفة الكائن الدقيق / الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية) إلى ثلاث طرق متميزة. تستلزم الطريقة الأولى الإزالة المباشرة لقسم منفصل من البيئة لنقله إلى غرفة نمو في المختبر تحتوي بالفعل على الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية داخل الغشاء. يعمل القسم المنفصل (على سبيل المثال ، مياه البحر) على تزويد الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية بالموائل الجيوكيميائية التي تستخدمها في الموقع ، بينما يوقف الغشاء حركة الخلايا عبر (ستبقى الخلايا ذات الأهمية في الداخل ؛ ستبقى الخلايا الدخيلة التي وصلت مع القسم المنفصل بدونها). من خلال تضمين المركبات المتاحة بشكل طبيعي لاستهداف الكائنات الحية الدقيقة في بيئتها الطبيعية ، يمكن استزراع هذه الكائنات الحية الدقيقة8. تستخدم الطريقة الثانية metatranscriptomics أو علم الجينوم لتوضيح القدرات الأيضية ، مما يوفر أدلة على معلمات الاستزراع الضيقة لتصميم وسيط مستهدف. يوفر هذا النهج ملفا فسيولوجيا بيئيا يمكن استخدامه لاستهداف إثراء أنواع معينة من الكائنات الحية الدقيقة خارج البيئة. تلبي أحكام الوسط الجينات المحددة الموجودة والتي يفترض أنها تدعم الكائن (الكائنات) الدقيقة المستهدفة لتقليل تنوع الإثراء،9،10. أحد التحذيرات هو أن المعلومات الجينومية لا تستنتج بشكل مباشر التعبير عن الجينات ، في حين أن المعلومات النسخية تفعل ذلك.
وتشمل الطريقة الثالثة وسائط مستنيرة بيئيا ومحاكاة، تختلف عن الطريقة الأولى، التي لا تحاكي وسائط الإعلام بل تستخدم البيئة مباشرة كمصدر للوسائط. تتطلب هذه الطريقة الثالثة استطلاعا بيئيا للكيمياء الجيولوجية لموقع ميداني يحتوي على كائنات دقيقة ذات أهمية. مع هذه المعرفة ، يتم تحديد المكونات الأولية والمعلمات الفيزيائية لإنتاج وسيط محاكاة مستنير بيئيا. ثم يتلقى الوسط ضخا مباشرا للرواسب أو السائل المحتوي على الكائنات الحية الدقيقة من البيئة إلى الوسط. هذه الطريقة ذات قيمة خاصة في الحالات التي لا يستطيع فيها عالم الأحياء الدقيقة المستزرع الوصول إلى كميات كافية من بيئة المصدر (حسب الحاجة للطريقة الأولى) ولا البيانات الوصفية أو الجينومية المناسبة (حسب الحاجة للطريقة الثانية).
البروتوكول التالي هو مثال على الطريقة الثالثة ؛ يتم إعلامه ويهدف إلى محاكاة البيئات ذات الاهتمام. يتم تقديم ثلاث وصفات إعلامية ساذجة تستهدف ثقافات الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية المختلفة المكتسبة في هذا المجال بالتوازي داخل البروتوكول. الثقافات الثلاث الممثلة هي مزارع مختلطة تنشأ من التربة (فيما يلي ، ثقافة التربة المختلطة) ، ومزارع مختلطة تنشأ من داخل بئر (فيما يلي ، ثقافة مختلطة للبئر) ، وميثانوجين معزول ينشأ من داخل بئر (يشار إليه فيما بعد ، ميثانوجين معزول عن الآبار). يقصد بالهويات المركبة والكميات في وصفات الوسائط المشتركة هنا أن تكون دليلا أوليا. إنهم قادرون ومشجعون على تخصيصها لبيئة القارئ والكائنات الحية الدقيقة ذات الاهتمام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يدين قسم الإنتاج المتوسط من هذا البروتوكول (القسم 1) بهيكله إلى تقنية Hungate المعدلة ل Miller and Wolin17 ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع منذ نشرها. يأتي التطبيق العملي لهذا البروتوكول الموسع من طبيعته الوصفية واقترانه باكتساب الكائنات الحية الدقيقة في الموقع . تم استخدام زجاجات …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون الاعتراف بنسب المعلومات والإرشاد التي أثرت / طورت هذه التقنيات على مر السنين. يدين الدكتور هاميلتون بريم كطالب دراسات عليا سابق ، وما بعد الدكتوراه ، وأستاذ حالي بالامتنان لأولئك الذين أخذوا الوقت الكافي لتدريس التقنيات اللاهوائية: الدكتور مايك آدامز ، والدكتور جيرتي شوت ، والدكتور جيم إلكينز ، والدكتور ميرسيا بودار ، والدكتور دوان موسر ، والدكتور بريان هيدلوند. دعمت منظمة الحفاظ على الطبيعة والأنهار الأمريكية هذا العمل من خلال المنح G21-026-CON-P و AR-CE21GOS373 ، على التوالي. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات معبر عنها في هذه الورقة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة آراء منظمة الحفاظ على الطبيعة أو الأنهار الأمريكية. تم دعم هذا العمل بمنحة من معهد الطاقة المتقدمة SIU ، والذي يعترف بامتنان بالتمويل الممنوح من خلال مجلس موارد الطاقة المتقدمة. تم تنفيذ NGS بواسطة LC Sciences.
Materials
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the’omics’ age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- . Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013)
- . Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018)
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).
