Isolement immunomagnétique des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire chez la souris
Summary
Cette étude a permis d’établir une méthode stable et efficace pour l’isolement, la culture et la détermination fonctionnelle des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire (CD34+ VW-SC). Cette méthode d’isolement facile à suivre et rapide peut être utilisée par d’autres chercheurs pour étudier les mécanismes potentiels impliqués dans les maladies cardiovasculaires.
Abstract
Les cellules souches et progénitrices résidentes de la paroi vasculaire CD34+ (VW-SC) sont de plus en plus reconnues pour leur rôle crucial dans la régulation et la réparation des lésions vasculaires. La mise en place d’une méthode stable et efficace pour cultiver des VW-SC CD34+ murins fonctionnels est essentielle pour approfondir l’étude des mécanismes impliqués dans la prolifération, la migration et la différenciation de ces cellules dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. La méthode décrite combine le criblage par billes magnétiques et la cytométrie en flux pour purifier les VW-SC CD34+ résidents en culture primaire. Les cellules purifiées sont ensuite identifiées fonctionnellement par coloration par immunofluorescence et imagerie Ca2+ . En bref, les cellules vasculaires de l’adventice de l’aorte murine et de l’artère mésentérique sont obtenues par fixation par bloc tissulaire, suivie d’une sous-culture jusqu’à ce qu’elle atteigne un nombre de cellules d’au moins 1 × 107. Par la suite, les VW-SC CD34+ sont purifiés à l’aide du tri par billes magnétiques et de la cytométrie en flux. L’identification des VW-SC CD34+ implique une coloration par immunofluorescence cellulaire, tandis que la multipotence fonctionnelle est déterminée en exposant les cellules à un milieu de culture spécifique pour une différenciation orientée. De plus, la libération interne fonctionnelle de Ca2+ et l’entrée externe de Ca2+ sont évaluées à l’aide d’un poste de travail d’imagerie disponible dans le commerce dans des cellules chargées de Fura-2/AM exposées à l’ATP, à la caféine ou à la thapsigargine (TG). Cette méthode offre une technique stable et efficace pour isoler, cultiver et identifier les cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire, offrant l’opportunité d’études in vitro sur les mécanismes de régulation des VW-SC et le criblage de médicaments ciblés.
Introduction
La paroi vasculaire joue un rôle central dans le développement vasculaire, la régulation homéostatique et la progression des maladies vasculaires. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont révélé la présence de diverses lignées de cellules souches dans les artères. En 2004, le groupe du professeur Qingbo Xu a signalé pour la première fois l’existence de cellules souches/progénitrices vasculaires à la périphérie de la paroi vasculaire adulte, exprimant CD34, Sca-1, c-kit et Flk-11. Ces cellules souches vasculaires présentent un potentiel de différenciation et de prolifération multidirectionnel. Dans des conditions normales, ils restent relativement calmes ; Cependant, lorsqu’ils sont activés par des facteurs spécifiques, ils peuvent se différencier en cellules musculaires lisses, en cellules endothéliales et en fibroblastes. Alternativement, ils peuvent réguler la matrice périvasculaire et la formation de microvaisseaux par des effets paracrines pour favoriser la réparation ou le remodelage des vaisseaux blessés 2,3,4,5,6. Récemment, on a constaté que les cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire jouent un rôle dans la régénération des cellules endothéliales après une lésion du fil-guide de l’artère fémorale2. Par conséquent, l’isolement et la quantification des VW-SC CD34+ et l’examen des caractéristiques biologiques de base des cellules souches CD34+ sont cruciaux pour étudier plus avant les voies de signalisation impliquées dans la régulation des VW-SC CD34+.
Diverses méthodes de séparation cellulaire sont actuellement disponibles, y compris des techniques basées sur les caractéristiques de la culture cellulaire ou les propriétés physiques des cellules, telles que la centrifugation par gradient de densité, qui aboutit à des cellules triées contenant de nombreuses cellules non cibles et une pureté relativement faible 7,8,9,10,11,12 . Une autre technique couramment utilisée est le tri cellulaire assisté par fluorescence/magnétique. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est un système complexe avec des exigences techniques élevées, et il est relativement coûteux, prend du temps et affecte potentiellement l’activité des cellules triées13,14. Cependant, le tri cellulaire activé par magnétisme (MACS) est plus efficace et plus pratique, avec un taux de récupération et une activité cellulaire élevés et un impact moindre sur les applications en aval8. Par conséquent, dans ce protocole, nous avons appliqué MACS pour purifier les VW-SC CD34+ et identifié davantage les cellules par cytométrie en flux. La mise en place de méthodes d’isolement basées sur MACS pour étudier les cellules souches de la paroi vasculaire serait inestimable. Tout d’abord, il permet des études expérimentales de génétique et de biologie cellulaire. Deuxièmement, l’isolement et la culture efficaces des cellules souches résidentes de la paroi vasculaire permettent une évaluation et un dépistage systématiques des facteurs de signalisation régulant les fonctions des cellules souches. Troisièmement, l’identification de phénotypes cruciaux dans les cellules souches fournit un « contrôle de qualité » important dans l’évaluation de l’état cellulaire. Ainsi, l’identification de méthodes de purification pourrait être utile pour des applications similaires aux cellules souches analogues dérivées de vaisseaux.
Ce rapport fournit une démonstration détaillée d’une méthode stable et fiable pour la culture de CD34+ VW-SC, y compris l’identification cellulaire et l’évaluation fonctionnelle effectuées par cytométrie en flux, coloration par immunofluorescence et mesure de la signalisation Ca2+ . Cette étude fournit une base pour d’autres recherches approfondies sur la fonction des VW-SC CD34+ et leurs mécanismes de régulation dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude fournit une méthode rapide et pratique pour obtenir des VW-SC CD34+ fonctionnels à partir de l’aorte et des artères mésentériques de souris. Les VW-SC CD34+ obtenus par cette méthode ont une activité proliférative et des propriétés de différenciation multidirectionnelle. Les récepteurs triphosphate 1,4,5-trisphosphate d’inositol (IP3Rs), les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et les canaux calciques exploités par le stockage médient la libération et l’ent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82070502, 31972909, 32171099), du Programme des sciences et technologies du Sichuan de la province du Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Les auteurs tiennent à remercier Qingbo Xu de l’Université du Zhejiang pour son aide à la culture cellulaire, et les auteurs reconnaissent l’aide scientifique et technique de la plateforme de cytométrie en flux de la Southwest Medical University.
Materials
| 2% gelatin solution | Sigma | G1393 | |
| Anti-CD31 antibody | R&D | AF3628 | |
| Anti-CD34 antibody | Abcam | ab81289 | |
| Anti-c-kit antibody | CST | 77522 | |
| Anti-FITC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| Anti-FITC MicroBeads MACS | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| Anti-Flk- 1 antibody | Abcam | ab24313 | |
| Anti-Ki67 antibody | CST | 34330 | |
| Anti-PDGFRα antibody | Abcam | ab131591 | |
| Anti-Sca- 1 antibody | Invitrogen | 710952 | |
| CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC | eBioscience Invitrogen | 11-1401-82 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC | eBioscience Invitrogen | 17-0311-82 | |
| CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383 | Miltenyi Biotec | 130-117-775 | |
| cell culture hood | JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD | SW-CJ-2FD | |
| Centrifuge | CENCE | L530 | |
| CO2 incubators | Thermofisher Scientific | 4111 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | zeiss 980 | |
| DMEM High Glucose Medium | ATCC | 30-2002 | |
| EBM-2 culture medium | Lonza | CC-3162 | |
| FACSMelody | BD Biosciences | ||
| FACSMelody™ System | BD | ||
| Fetal bovine serum | Millipore | ES-009-C | |
| FM-2 culture medium | ScienCell | 2331 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen | M1292 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermofisher Scientific | A32731 | |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | LIF2010 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| MiniMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-312 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Beyotime | C0224 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | |
| TILLvisION 4.0 program | T.I.L.L.Photonics GmbH | polychrome V | |
| VWF Monoclonal Antibody (F8/86) | Thermofisher Scientific | MA5-14029 | |
| β-Mercaptoethanol | Thermofisher Scientific | 21985023 |
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