Ce protocole décrit un test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas qui permet de diagnostiquer le cancer au point d’intervention grâce à l’analyse ex vivo des activités protéases associées à la tumeur.
La création de biomarqueurs synthétiques pour le développement de diagnostics de précision a permis de détecter des maladies par des voies autres que celles utilisées pour les mesures traditionnelles des biofluides. Les biomarqueurs synthétiques utilisent généralement des rapporteurs qui fournissent des signaux lisibles dans le biofluide pour refléter les altérations biochimiques dans le microenvironnement local de la maladie au cours de l’incidence et de la progression de la maladie. La concentration pharmacocinétique des rapporteurs et l’amplification biochimique du signal de la maladie sont primordiales pour obtenir une sensibilité et une spécificité élevées dans un test diagnostique. Ici, une plateforme de diagnostic du cancer est construite à l’aide d’un format de biomarqueurs synthétiques : des nanocapteurs basés sur l’activité transportant des rapporteurs d’ADN chimiquement stabilisés qui peuvent être libérés par des signatures protéolytiques aberrantes dans le microenvironnement tumoral. L’ADN synthétique en tant que rapporteur de maladie offre une capacité de multiplexage grâce à son utilisation comme code-barres, permettant la lecture de plusieurs signatures protéolytiques à la fois. Les rapporteurs d’ADN libérés dans l’urine sont détectés à l’aide de nucléases CRISPR par hybridation avec des ARN CRISPR, qui à leur tour produisent un signal fluorescent ou colorimétrique lors de l’activation de l’enzyme. Dans ce protocole, des nanocapteurs basés sur l’activité sont construits et leur application est illustrée dans un modèle murin préclinique de cancer colorectal métastatique. Ce système est hautement modifiable en fonction de la biologie de la maladie et génère plusieurs signaux de maladie simultanément, permettant une compréhension complète des caractéristiques de la maladie grâce à un processus peu invasif ne nécessitant que l’administration de nanocapteurs, la collecte d’urine et un test papier qui permet des diagnostics sur le lieu d’intervention.
Malgré les efforts importants déployés pour identifier les biomarqueurs tumoraux tels que les protéines excrétées et l’ADN, le domaine du diagnostic du cancer a été mis à rude épreuve par leur faible abondance ou leur dégradation rapide dans la circulation1. En tant que stratégie complémentaire, les biomarqueurs synthétiques issus de la bio-ingénierie qui répondent sélectivement aux caractéristiques de la maladie pour générer des signaux amplifiés représentent de nouvelles voies vers des diagnostics précis et accessibles 2,3. Pour faciliter la détection, ces biomarqueurs synthétiques exploitent les mécanismes d’activation dépendants de la tumeur tels que l’amplification enzymatique pour produire des analytes avec un rapport signal/bruit amélioré4. Ici, une classe d’enzymes associées au cancer, les protéases, est exploitée pour activer des capteurs injectables à l’échelle nanométrique afin de libérer des rapporteurs de maladies détectables à partir des biofluides tels que le sang ou l’urine 5,6. Compte tenu de l’hétérogénéité tumorale, le développement d’un panel de capteurs activés par la protéase permet d’effectuer des tests multianalytes qui combinent différents événements de clivage de la protéase en une « signature de la maladie » pour évaluer l’incidence et la progression du cancer d’une manière plus spécifique et multiplexée.
Des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase ont été développés qui comprennent des substrats peptidiques conjugués à la surface d’un support inerte7. Lorsqu’ils sont injectés in vivo, ces peptides sont transportés vers la tumeur, après quoi le clivage enzymatique par les protéases tumorales libère des rapporteurs dans le sang ou l’urine pour détection. La détection multiplexée avec des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase nécessite que chaque biomarqueur synthétique d’un cocktail soit marqué avec un code-barres moléculaire unique. À cette fin, diverses approches ont été développées, notamment des codes-barres de masse et des rapporteurs codés par ligands 8,9,10. Contrairement à ces méthodes de multiplexage qui peuvent être limitées à quelques possibilités de signaux différentes, le codage à barres de l’ADN offre beaucoup plus de combinaisons en fonction de la grande complexité et de l’hétérogénéité des états pathologiques humains. Pour étendre la multiplexité des biomarqueurs synthétiques, les capteurs sont codés à barres en étiquetant chaque rapporteur avec une séquence d’ADN unique pour la détection via la nucléase CRISPR-Cas afin d’amplifier le signal biofluidique ex vivo. Ces codes-barres d’ADN simple brin (ADNss) sont conçus pour se lier à des ARN guides CRISPR complémentaires (ARNcr), activant l’activité des nucléases collatérales déclenchées par la cible de CRISPR-Cas12a11. Cette activité nucléase peut être utilisée pour cliver un brin d’ADN rapporteur détecté par cinétique de fluorescence ou à l’aide de bandes de papier.
En plus de l’amplification moléculaire via des protéases (in vivo) et CRISPR-Cas (ex vivo), une autre caractéristique clé de la conception des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase consiste à exploiter la pharmacocinétique des nanomatériaux pour augmenter la concentration du signal diagnostique dans les biofluides10. Une approche consiste à utiliser un transporteur de nanoparticules pour augmenter le temps de circulation des substrats peptidiques conjugués à la surface. Un dendrimère en polyéthylène glycol (PEG) est sélectionné comme nanotransporteur avec un diamètre hydrodynamique et une multivalence relativement petits pour augmenter l’administration aux tumeurs. Bien qu’elle soit suffisamment petite pour favoriser l’administration de la tumeur, la taille du porteur de PEG est supérieure à la coupure de ~5 nm de la barrière de filtration glomérulaire rénale, de sorte que seuls les substrats peptidiques clivés peuvent être éliminés dans l’urine, en profitant de la filtration par les reins12. Dans ce protocole, le flux de travail en plusieurs étapes est décrit pour la synthèse et l’application de nanocapteurs basés sur l’activité à code-barres de l’ADN dans un modèle murin préclinique, mettant en évidence la configuration du test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas, qui a été utilisé par ce groupe pour classer l’état de la maladie dans des modèles murins de plusieurs types de cancer13. Grâce au principe de conception polyvalent, les trois composants fonctionnels du nanocapteur – le nanotransporteur (polymère PEG), le module sensible aux stimuli (substrat activé par la protéase) et le rapporteur biofluidique (code-barres ADN) – peuvent être interchangés avec précision en fonction des besoins spécifiques de l’application, ce qui permet une modularité en adaptant les spécificités de la cible et de la libération.
Voici une plateforme hautement personnalisable pour la détection multiplexée du cancer avec un test d’urine portable qui évalue l’activité protéolytique associée à la maladie à l’aide d’un capteur injecté mini-invasif. Lorsqu’il est activé par les protéases tumorales, le clivage du substrat peptidique est amplifié par la libération d’un code-barres d’ADN dans l’urine. Les rapporteurs d’ADN synthétique dans un échantillon d’urine peuvent être lus par une amplification enzymatiq…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée en partie par une subvention de soutien de l’Institut Koch P30-CA14051 de l’Institut national du cancer (Swanson Biotechnology Center), une subvention du centre de base P30-ES002109 de l’Institut national des sciences de la santé environnementale, le Marble Center for Cancer Nanomedicine de l’Institut Koch, le programme de recherche exploratoire de l’Institut Koch via le Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, et le Fonds de Virginie et D. K. Ludwig pour la recherche sur le cancer. L’A.E.V.H. est soutenue par une bourse de formation prédoctorale (T32GM130546) financée par les NIH. S.N.B. est un chercheur de l’Institut médical Howard Hughes. L.H. est soutenu par un prix K99/R00 Pathway to Independence du National Cancer Institute et le financement de démarrage de l’Université de Boston.
10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |