Production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour l’enrobage de la boîte de culture

Des tissus cardiaques ont été prélevés chez des patients atteints d’insuffisance cardiaque terminale due à une cardiopathie ischémique qui subissaient une transplantation cardiaque. Tous les échantillons utilisés pour les expériences ont été collectés avec le consentement du patient et sans identification du patient, conformément aux protocoles approuvés par le comité d’éthique de l’Université de Naples Federico II et conformément aux principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki. Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux. 1. Préparation de l’expérience Préparez des outils ou des appareils stériles : une grande paire de ciseaux chirurgicaux, deux paires de pinces fines, deux paires de ciseaux de microdissection, une bouteille stérile de 1 L, une bouteille stérile de 500 ml et une bouteille stérile de 250 ml. Désinfectez les lunettes de protection de 22 mm x 22 mm avec de l’éthanol à 70 % pendant quelques secondes. Aspirez l’éthanol à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, laissez sécher les verres de protection au four à 37 °C et stérilisez-les dans un autoclave. Dissoudre les sels en poudre disponibles dans le commerce dans de l’eau stérile bidistillée. Dans une bouteille stérile de 1 L, ajoutez 0,35 g de poudre de bicarbonate de sodium pour préparer 1 L de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à pH 7,4. Stériliser la solution à l’aide de membranes filtrantes de 0,22 μm sous une hotte stérile et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Peser 0,1 g de phosphate de potassium monobasique, 4,0 g de chlorure de sodium, 0,1 g de chlorure de potassium et 0,575 g de phosphate dibasique de sodium pour préparer 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dissoudre les composants dans de l’eau stérile bidistillée, puis vérifier la valeur du pH (7,4). Stériliser sous une hotte stérile par filtration et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Ajouter 5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) à 45 mL de HBSS pour préparer un volume final de 50 mL de solution stop de trypsine (TSS). Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Mesurer 223,75 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 25 mL de FBS (concentration finale, 10 %) et ajouter 1,25 mL de solution de pénicilline et de streptomycine (pen/streptocoque, concentration finale, 0,5 %) pour préparer le DMEM pour l’isolement et la culture des fibroblastes. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Préparez une solution de gélatine à 0,2 % (p/v) en ajoutant 0,2 g de gélatine de poudre de peau de porc à 100 ml de PBS.REMARQUE : Les composants et les concentrations respectives de chaque solution utilisée dans l’étude sont indiqués dans le tableau 1. 2. Culture primitive de fibroblastes cardiaques humains par excroissance de fragments de myocarde auriculaire REMARQUES : Les étapes 2.2-2.3 doivent être effectuées dans des conditions stériles. Le protocole est validé pour des échantillons auriculaires d’environ 0,3 cm de diamètre, ce qui est une dimension typique des échantillons de biopsie et permet l’isolement d’environ 2 x 106 fibroblastes. Lavez l’échantillon fraîchement obtenu de l’oreillette dans une plaque de verre de 100 mm avec du HBSS stérile, en le secouant doucement pour éliminer le sang. Répétez cette étape trois fois, en changeant HBSS et la plaque à chaque lavage. Placez l’échantillon dans une plaque de 100 mm préalablement humidifiée avec un petit volume de HBSS et hachez-le finement avec des scalpels croisés en cubes d’environ 2 mm. Placez quatre petits fragments de myocarde dans une plaque de 35 mm, suffisamment près pour qu’elle repose à peu près à l’angle d’un verre de protection de 22 mm x 22 mm, placez le verre de couverture stérile sur les fragments, appliquez une légère pression et ajoutez 1,5 ml de DMEM. Incuber les plaques de culture à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant environ 15 jours ou jusqu’à ce que les cellules atteignent 85 % de confluence, en vérifiant quotidiennement la croissance des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé et en changeant le milieu de culture tous les 3 jours. 3. Sous-culture de fibroblastes cardiaques humains par trypsinisation à chaud REMARQUES : Les étapes indiquées ci-dessous doivent être effectuées dans des conditions stériles. Comme les fibroblastes peuvent migrer à partir du tissu explanté le long de la surface du verre de couverture et de la plaque de culture, il est recommandé de traiter les deux pour la première sous-culture. Soulevez le verre de protection à l’aide d’une pince fine et stérile, placez-le à l’envers dans une nouvelle plaque de 35 mm et rincez-le avec du PBS stérile. Retirez les fragments de myocarde, jetez-les et rincez la plaque de 35 mm avec des cellules exparcées avec du PBS stérile. Jeter le rinçage et ajouter 1 mL de trypsine-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) à 0,25 % dans chaque assiette. Incuber 5 min à 37 °C avec 5% de CO2. Confirmez le décollement cellulaire au microscope. Les cellules doivent être complètement arrondies et détachées, formant de petits amas. Bloquer la trypsinisation en ajoutant 2 mL de MES dans chaque plaque de 35 mm et recueillir la suspension dans un tube stérile de 15 mL, centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, remettre la pastille en suspension dans 3 mL de DMEM et placer la suspension cellulaire dans une plaque de 60 mm. Incuber les cellules obtenues en sous-culture 1 (ou passage 1) dans 3 mL de DMEM à 37 °C avec 5% de CO2, en changeant le milieu tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 75% de confluence. Sous-culture des fibroblastes qui ont atteint 75% de confluence, répétant la trypsinisation à chaud et divisant les cellules 1:3 en nouvelles plaques de 60 mm jusqu’à deux fois (passages 2 et 3). 4. Dépôt de matrice extracellulaire Préparer des plats enrobés de gélatine en ajoutant 3 mL de solution de gélatine stérile à 0,2 % dans chaque plaque de 60 mm et en laissant incuber à 37 °C pendant 2 h ; puis aspirer la solution et ajouter 3 mL de PBS stérile jusqu’à utilisation. Détacher les fibroblastes cardiaques par trypsinisation à chaud et les sous-cultiver à haute densité (15 x 10,3 cellules parcm2) sur des plaques de 60 mm recouvertes de gélatine. Cultivez les fibroblastes à l’état confluent jusqu’à 21 jours, ce qui permet la synthèse et le dépôt de matrice extracellulaire. Remplacer 50% du milieu par du milieu frais tous les 3 jours. 5. Décellularisation de la matrice extracellulaire REMARQUE : Les étapes 5.3-5.4 doivent être effectuées avec une légère agitation pour déloger uniquement les cellules sans détacher la matrice extracellulaire. Préparez une solution de décellularisation contenant 0,25 % de Triton X-100 et 10 mM de NH4OH dans du PBS (calculer le volume final, en considérant 1 mL pour chaque plaque de 60 mm). Retirez le milieu de culture et rincez les plaques avec du PBS. Jetez le rinçage. Ajouter 1 mL de solution de décellularisation et observer les plaques au microscope à contraste de phase inversé ; après 1 à 2 min, lorsque les cellules ne sont plus discernables, ajoutez doucement 4 ml de PBS pour diluer la solution de décellularisation. Retirez la solution diluée et rincez doucement les plaques avec du PBS ; jeter le rinçage. Ajouter 1 mL de PBS et stocker les plaques revêtues d’ECM à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.