ゼブラフィッシュ振動驚愕応答スクリーニングシステムを用いた化学物質の毒性評価

すべてのゼブラフィッシュの飼育と取り扱いは、ドイツの動物保護基準に準拠して行われ、ドイツのバーデン・ヴュルテンベルク州政府、Regierungspräsidium Karlsruhe(Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT)によって承認されました。 1. 試験する薬品の原液の調製 ガラスバイアル(または化学アリコート)に、化合物名/略語、在庫濃度、および調製日をラベル付けします。例えば、CdCl2_2.5 g·L-1_210813です。 化学アリコートを2000 x g で室温(RT)で1分間遠心分離します。 ドラフトの下で、0.001 gに敏感なスケールで化合物を(必要に応じて)秤量し、ラベル付きバイアルに移します。.コンパウンドが液体の場合は、ピペットとプラスチック製のピペットチップを使用してバイアルに加えます。注: 例えば、図 2 に示す結果例で使用したトリケインメタンスルホン酸ストックについて、400 mg を標識バイアルに秤量しました。 溶媒(化合物の物理化学的特性に応じて滅菌純水やジメチルスルホキシド(DMSO)など)を、ピペットとプラスチック製のピペットチップを使用して添加します。可能であれば、水が好ましい溶媒です。注:例えば、トリケインストックの場合、100 mL の水に 15.3 mM 溶液を調製しました。 バイアルを密封し、静かに振とうし、沈殿物を確認します。 希薄なストック溶液(必要な場合)をガラスバイアルにピペットとプラスチック製のピペットチップを使用して調製します。注:例えば、トリケインストックについては、それ以上の希釈は必要ありませんでした。 原液は、使用するまで-20°Cで保存してください。 残りの化学アリコートは、以前と同じ条件で保管してください。 ラボノートに在庫分注情報を記録します。 2. ゼブラフィッシュ胚の採取と飼育 10cmの組織培養皿でのグループ交配の自然産卵から、切断段階(2〜8細胞段階)の胚を収集します。 適切な品質のバッチを選択してください:10%未満の未受精卵/死んだ卵。 皿をきれいにします(未受精卵、破片、鱗屑などを取り除きます)。 10 cmの組織培養皿あたり60個の胚を15 mLのE3培地(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4)25に入れます。 水に浸したペーパータオルを敷いて用意した加湿チャンバーに食器を入れます。 28.5°Cのインキュベーターで72hpfまで胚を育てます。 3.試験する化学物質の作業希釈液の準備 原液を-20°Cの冷凍庫から取り出し、解凍します。 化合物の溶解度が十分に高い場合は、ガラス瓶の E3 培地で段階希釈液を調製し、1 濃度あたり 1 回あたり 1 mL を調製します。濃度が所望の曝露濃度の10倍であることを確認してください。これにより、曝露開始時に胚の培地全体を変更する必要がなくなります。溶解度が低い場合は、所望の曝露濃度(1 回あたり 10 mL、濃度あたり 10 mL)で段階希釈液を直接調製します。 降水量を確認します(必要な場合)。溶液が沈殿している場合は、これを記録し、さらに希釈して次に高い濃度にします。降水量をもう一度確認してください。降水量がなくなるまで繰り返します。 曝露溶液のpHを確認してください。pH 7.0-8.5の範囲外の場合は、これを記録し、5 mM HEPES / pH 7.4を含むE3で溶液を調製し、HClまたはNaOHでpHを調整します。 未使用の露光メディアは、地域の規制に従って廃棄してください。 4.試験する化学物質に胚を曝露する 72 hpfの古い胚で皿に死んだ/孵化していない胚がないか確認し、それらを取り除きます。胚のバッチに孵化していない卵が5%以上含まれている場合は、バッチを削除します。 6cmの組織培養皿あたり10個の胚を9 mLのE3培地(エクスポージャープレート)に入れます。 曝露プレートに化合物名、曝露濃度、および繰り返し数をラベル付けします。例えば、「CdCl2 1mg·L-1 01」です。必要に応じて、十分な E3 専用プレートと溶媒コントロールプレートを含めます(セクション 5 を参照)。 各プレートに1 mLの曝露溶液を最低濃度から加え、プレートを旋回させます。溶解度の低い化合物の場合は、プレートの 10 mL 全体を曝露溶液と交換します(ステップ 3.2 を参照)。 化合物溶液が胚に添加された時間的順序を記録します。 プレートを加湿チャンバー内のインキュベーターで28.5°C、48時間、120hpfに達するまでインキュベートします。 5. 振動驚愕アッセイの実施 注:ステップ4.5で記録したのと同じ順序でプレートを分析します。各実行には、E3コントロールプレートを含める必要があります。 コンピュータとバイブレーションデバイスの電源を入れます(青色のLEDライトが点灯しているはずです)。 図 1D に示すように、スプレッドシートで構成ファイルを準備し、補足ファイル 1 として添付します。5 つのプレート位置(化合物、濃度、繰り返し)のそれぞれの曝露情報を記録します。 一般的なユーザー インターフェイス (GUI) プログラム (https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit 、プロジェクト ID 43215 で入手可能) を開きます。 GUIプログラムでさまざまな位置を選択し、カメラの動きを観察して、カメラの動きを確認します。 測定するサンプルプレートをインキュベーターから取り出します。サンプルプレートを5つの位置に置き( 図1A「スピーカー」を参照)、胚を数分間落ち着かせます。 [記録]をクリックします。構成ファイルを選択するためのウィンドウが開きます。 この実行のために手順 5.2 で準備した適切な構成ファイルを選択します。 サンプルの説明が各位置(1-5)のサンプルに対応していることを確認します。 測定は自動で行われます(10秒/位置)。プログラムによって音波パルスが印加されると、LEDが点灯します。10秒/位置の記録により、刺激を加える前と後の両方で遊泳速度と移動距離を推定するのに十分なデータを取得でき、その後の刺激に慣れるのを防ぐことができます。 録画が完了すると、カメラは位置1に戻り、ソフトウェアはファイルの圧縮を開始します。この間に、サンプルを測定が必要な次のセットと交換します。 手順 5.2 に進みます。をクリックして、次の実行を記録します。 すべてのプレートを測定したら、曝露溶液を回収します。ふるいを使用して胚を保持します。 氷/イソプロパノール(5%)浴で急冷して胚を安楽死させます。 曝露溶液と死んだ胚は、地域の規制に従って廃棄してください。 6. データ解析 VirtualDub(1.10.4)で動画データを開きます。 音波パルスに反応する胚の数を視覚的にスコアリングします(制御LEDが点灯している場合)。 スプレッドシートにデータを入力します。化合物名、複製数、化合物の濃度、および不動性胚の割合を、図 2C に示すサンプルデータセットを含む補足ファイル 2 に記載されているテンプレートに従って記録します。注:テンプレートは柔軟な構造を持ち、主に他の生物やエンドポイントのデータに適用できます。各濃度の応答を記述し、エンドポイントの説明と、その後の濃度-応答モデリングで生成されるパラメータの定義も提供します。 埋め込まれた R スクリプト (R バージョン 3.6、R パッケージ plotrix、drc、bmd27、28) を備えた KNIME ワークフロー (KNIME analytics 4.626) を使用して、ベンチマーク濃度 (BMC) 分析を実行します。注: 原則として、評価は R で直接実施することもできます。ただし、便宜上、また Web ベースのサービスとして評価できるように、分析は KNIME サーバー準拠のワークフローで編成されています。KNIME ワークフローの出力は、 補足ファイル 3 で提供されます。KNIME ワークフローによって生成される統計パラメータの詳細については、このテンプレートを参照してください。適合度を推定するための統計的パラメータと、決定されたBMC値を受け入れるための閾値を 表1に示す。KNIME ワークフロー自体は、GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc) から入手できます。濃度-応答は、4 パラメーターの対数ロジスティック モデルを使用してモデル化されます。カーブフィットのパラメータのうち2つは固定できます。通常、パーセンテージ データの場合、最大値を 100 に固定します。背景効果が観察されない場合は、最小値を0%に固定できます。