使用斑马鱼振动惊吓反应筛查系统评估化学品的毒性

所有斑马鱼的饲养和处理均符合德国动物保护标准，并得到德国卡尔斯鲁厄州巴登-符腾堡州政府的批准（Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT）。 1. 制备待测化学品的储备溶液 在玻璃小瓶（或化学等分试样）上标明化合物名称/缩写、原液浓度和制备日期。例如，CdCl2_2.5 g·L-1_210813。 在室温（RT）下以2000× g 离心化学等分试样1分钟。 在通风橱下，在对0.001g敏感的秤上称量化合物（如有必要），并将其转移到标记的小瓶中。如果化合物是液体，请使用移液管和塑料移液器吸头将其添加到小瓶中。注：例如，对于 图2所示结果示例中使用的甲磺酸三卡因原液，将400mg称量到标记的小瓶中。 使用移液管和塑料移液器吸头加入溶剂（例如，无菌纯水或二甲基亚砜（DMSO），具体取决于化合物的物理化学性质）。如果可能，水是首选溶剂。注：例如，对于三卡因原液，制备了 100 mL 水中的 15.3 mM 溶液。 密封小瓶，轻轻摇晃，检查是否有沉淀。 使用移液器和塑料移液器吸头在玻璃瓶中制备稀释的储备溶液（如有必要）。注意：例如，三卡因原液不需要进一步稀释。 将储备溶液储存在-20°C直至使用。 将剩余的化学等分试样储存在与以前相同的条件下。 在实验室笔记本中记录库存等分试样信息。 2. 收集和饲养斑马鱼胚胎 在10cm组织培养皿中从群体交配的自然产卵中收集卵裂阶段（2-8细胞阶段）的胚胎。 选择一批质量合适的鸡蛋：未受精/死卵少于10%。 清洁餐具（去除未受精的卵、碎屑、鳞片等）。 将每 10 cm 组织培养皿 60 个胚胎放入 15 mL E3 培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）25 中。 将盘子放入湿润的腔室中，铺上浸有水的纸巾。 在28.5°C的培养箱中将胚胎培养至72hpf。 3. 准备待测化学品的工作稀释 从-20°C冰箱中取出储备溶液，使其解冻。 如果化合物溶解度足够高，则在玻璃瓶中的E3培养基中制备连续稀释液，每次重复1mL，浓度。确保浓度比所需的暴露浓度高 10 倍。这避免了在暴露开始时必须更换胚胎的整个培养基。在溶解度低的情况下，直接以所需的暴露浓度制备系列稀释液，每次重复10 mL。 检查降水（如有必要）。如果溶液已经沉淀，请记录下来，然后进一步稀释以达到下一个最高浓度。再次检查降水。重复直到没有降水。 检查暴露溶液的pH值。如果超出pH 7.0-8.5范围，则记录下来，并在含有5mM HEPES/pH 7.4的E3中制备溶液，用HCl或NaOH调节pH值。 根据当地法规处理未使用的暴露介质。 4. 将胚胎暴露在待测化学物质中 用 72 hpf 的胚胎检查培养皿中是否有死亡/未孵化的胚胎并将它们取出。如果一批胚胎含有超过 5% 的未孵化卵，请取出该批。 将每 6 cm 组织培养皿 10 个胚胎放入 9 mL E3 培养基（暴露板）中。 用化合物名称、暴露浓度和重复数标记曝光板。例如，“CdCl2 1 mg·L-1 01“。如果需要，包括足够的仅限 E3 的板和溶剂对照板（参见第 5 节）。 向每个板中加入 1 mL 暴露溶液，从最低浓度开始，然后旋转板。对于溶解度低的化合物，用暴露溶液替换整个 10 mL 板（参见步骤 3.2。 记录将复合溶液添加到胚胎中的时间顺序。 将板在28.5°C的培养箱中的加湿室中孵育48小时，直至达到120hpf。 5. 进行振动惊吓测定 注意：按照步骤4.5中记录的相同顺序分析板。每次运行都应包括一个 E3 控制板。 打开电脑和振动装置（蓝色LED灯应亮）。 在电子表格中准备配置文件，如 图 1D 所示，并作为 补充文件 1 附上。记录 5 个板位置（复合、浓缩、重复）中每个位置的暴露信息。 打开常规用户界面 （GUI） 程序（位于 https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit ，项目 ID 43215。 通过在 GUI 程序中选择不同的位置并观察相机移动来检查相机运动。 从培养箱中取出要测量的样品板。将样品板放在5个位置（见 图1A，“扬声器”），让胚胎沉降几分钟。 点击 记录;将打开一个窗口以选择配置文件。 选择在步骤 5.2 中为此运行准备的相应配置文件。 检查样品描述是否与每个位置 （1-5） 上的样品相对应。 测量将自动进行（10 秒/位置）。当程序施加声脉冲时，LED 亮起。记录 10 秒/位置可以获取足够的数据来估计施加刺激前后的游泳速度和行进距离，并防止习惯随后的刺激。 录制完成后，相机返回位置 1，软件开始压缩文件。在此期间，用需要测量的下一组样品替换样品。 转到步骤 5.2。以记录下一次运行。 测量完所有板后，收集曝光溶液。使用筛子保留胚胎。 在冰/异丙醇（5%）浴中快速冷却胚胎。 根据当地法规处理暴露溶液和死胚胎。 6. 数据分析 使用 VirtualDub （1.10.4） 打开视频数据。 直观地对响应声脉冲的胚胎数量进行评分（当控制 LED 亮起时）。 在电子表格中输入数据。根据 补充文件2中提供的模板记录化合物名称，重复，化合物的浓度和不动胚胎的百分比，其中包括 图2C所示的示例数据集。注意：该模板具有灵活的结构，主要允许应用其他生物体和终点的数据。它描述了每个浓度的响应，还提供了终点描述以及后续浓度响应建模中生成的参数的定义。 使用 KNIME 工作流程（KNIME 分析 4.626）和嵌入式 R 脚本（R 版本 3.6、R-packages plotrix、drc 和 bmd 27,28）进行基准浓度 （BMC） 分析。注：原则上，评估也可以直接在R中进行。但是，为了方便起见，并允许将评估作为基于Web的服务，分析已在符合KNIME服务器的工作流程中组织。KNIME 工作流程的输出在 补充文件 3 中提供。有关KNIME工作流生成的统计参数的详细信息，请参阅此模板。 表 1 显示了估计拟合优度的统计参数和接受确定的 BMC 值的阈值。KNIME 工作流程本身可通过 GitHub （https://github.com/precisiontox/range-finding-drc） 获得。浓度响应使用 4 参数对数逻辑模型进行建模。其中两个曲线拟合参数可以固定。通常，在百分比数据的情况下，会将最大值固定为 100。如果没有观察到背景效应，最小值可以固定为 0%。