Identification des populations microenvironnementales de moelle osseuse dans le syndrome myélodysplasique et la leucémie myéloïde aiguë
Summary
Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.
Abstract
Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de populations cellulaires distinctes, telles que les cellules stromales mésenchymateuses, les cellules endothéliales, les cellules ostéolignées et les fibroblastes, qui soutiennent les cellules souches hématopoïétiques (CSH). En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse joue également un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques, tels que les syndromes myélodysplasiques (SMD) et la leucémie myéloïde aiguë (LAM). Les mutations associées aux SMD dans les CSH entraînent un blocage de la différenciation et une insuffisance progressive de la moelle osseuse, en particulier chez les personnes âgées. Le SMD peut souvent évoluer vers une LAM résistante au traitement, une maladie caractérisée par une accumulation rapide de blastes myéloïdes immatures. On sait que le microenvironnement de la moelle osseuse est altéré chez les patients atteints de ces néoplasmes myéloïdes. Ici, un protocole complet pour isoler et caractériser phénotypiquement les cellules microenvironnementales de la moelle osseuse à partir de modèles murins de syndrome myélodysplasique et de leucémie myéloïde aiguë est décrit. L’isolement et la caractérisation des changements dans les populations de niche de la moelle osseuse peuvent aider à déterminer leur rôle dans l’initiation et la progression de la maladie et peuvent conduire à la mise au point de nouvelles thérapies ciblant les altérations favorisant le cancer dans les populations stromales de la moelle osseuse.
Introduction
Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de cellules hématopoïétiques, de cellules stromales non hématopoïétiques et de la matrice extracellulaire 1,2. Ce microenvironnement peut favoriser l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, réguler la différenciation des lignées et fournir un soutien structurel et mécanique au tissu osseux 1,2,3,4,5. La niche stromale comprend les cellules ostéolinéaires, les fibroblastes, les cellules nerveuses et les cellules endothéliales6, tandis que la niche hématopoïétique comprend les populations lymphoïdes et myéloïdes 1,2,3. En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse peut également jouer un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques tels que le SMD et la LMA 7,8,9,10,11. Il a été démontré que les mutations dans les cellules ostéoliférantes favorisent le développement du SMD, de la LAM et d’autres néoplasmes myéloprolifératifs 10,12,13,14.
Les syndromes myélodysplasiques sont un groupe de troubles pré-leucémiques qui résultent de mutations dans les cellules souches hématopoïétiques. Le SMD est souvent associé à un blocage de la différenciation des CSH et à la production de cellules dysplasiques, ce qui peut souvent entraîner une insuffisance de la moelle osseuse. Le SMD est le néoplasme myéloïde le plus fréquemment diagnostiqué aux États-Unis et est associé à un taux de survie à 3 ans de 35 % à 45 %15. Le SMD est souvent associé à un risque élevé de transformation en leucémie myéloïde aiguë. Il peut s’agir d’une complication fatale, car la LMA dérivée du SMD est résistante à la plupart des thérapies et susceptible de rechuter. La LAM qui survient de novo en raison de translocations ou de mutations dans la tige hématopoïétique et les progéniteurs est également souvent résistante à la chimiothérapie standard16,17. Étant donné que le SMD et la LMA sont principalement des maladies de personnes âgées, la majorité d’entre eux étant diagnostiqués avant l’âge de 60 ans, la plupart des patients ne sont pas admissibles à une greffe de moelle osseuse curative. Il y a donc un besoin important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. Étant donné que le microenvironnement de la moelle osseuse peut fournir un soutien aux cellules malignes14, la définition des changements dans la niche de la moelle osseuse avec la progression de la maladie peut conduire à l’identification de nouvelles thérapies visant à inhiber le remodelage de la niche tumorale. Il est donc important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. À cette fin, il est essentiel d’identifier et de caractériser les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse qui peuvent fournir un soutien aux cellules malignes.
Plusieurs modèles murins de LAM et de SMD ont été générés et peuvent être utilisés pour étudier les changements dans le microenvironnement de la moelle osseuse au cours de l’initiation et de la progression de la maladie 6,1,19,20,21,22. Ici, les protocoles permettant d’identifier les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse à l’aide de modèles murins de LAM 6,20 induite rétroviralement, ainsi que le modèle Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible dans le commerce de la transformation du SMD à haut risque en LAM19, sont décrits. Les souris transplantées avec des cellules de LAM de novo succombent à la maladie en 20 à 30 jours6. Les souris NHD13 développent des cytopénies et une dysplasie de la moelle osseuse vers 15 à 20 semaines, qui se transforme finalement en LAM, et près de 75 % des souris succombent à la maladie vers 32 semaines. Pour analyser les populations du microenvironnement de moelle osseuse modèle murin, les os sont prélevés, la moelle osseuse et les spicules osseux sont digérés par digestion enzymatique, puis les cellules sont enrichies pour les populations non hématopoïétiques CD45-/Ter119- par tri magnétique. Bien que des analyses similaires aient déjà été décrites 11,13,22,23,24,25, elles se concentrent souvent sur la moelle osseuse ou l’os et n’intègrent pas de cellules des deux sources dans leurs analyses. La caractérisation combinée de ces populations, en conjonction avec des analyses de l’expression génique, peut fournir une compréhension complète de la façon dont le microenvironnement hématopoïétique cellulaire fournit un soutien à l’initiation et à la progression de la maladie (Figure 1). Bien que le protocole décrit ci-dessous se concentre sur un modèle de LAM induite par rétroviralité et un modèle de SMD génétique, ces stratégies peuvent être facilement adaptées pour étudier les changements dans la niche de la moelle osseuse de n’importe quel modèle murin d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modèles de leucémie murine ont été largement utilisés pour identifier les signaux intrinsèques et de niche cellulaires qui favorisent la progression agressive de la leucémie myéloïde 6,19,21. Ici, un protocole complet basé sur la cytométrie en flux pour définir la composition cellulaire du microenvironnement de la moelle osseuse dans des modèles murins de SMD et de LAM est présenté.
<p class="jove_content"…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le centre de cytométrie en flux de l’URMC. Ces travaux ont été soutenus par le prix de l’American Society of Hematology, le prix de la Fondation pour la recherche sur la leucémie et les subventions du NIH R01DK133131 et R01CA266617 attribués à J.B.
Materials
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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