Summary

Test non invasif pour la détermination de la cinétique de biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis

Published: January 12, 2024
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Summary

Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.

Abstract

La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétiolement, l’une des étapes les plus dramatiques du cycle de vie des plantes. Le processus étroitement contrôlé et hautement dynamique de la biosynthèse de la chlorophylle est déclenché lors du passage de l’obscurité à la lumière chez les plantes à fleurs. Au moment où les plantules étiolées sont exposées aux premières traces de lumière du soleil, la conversion rapide (en quelques secondes) du protochlorophyllide en chlorophyllide est médiée par des complexes protéiques uniques acceptant la lumière, conduisant via des étapes métaboliques ultérieures à la production de chlorophylle pleinement fonctionnelle. Les techniques standard d’analyse de la teneur en chlorophylle comprennent l’extraction de pigments à partir de tissus végétaux détachés, ce qui ne s’applique pas à l’étude de processus aussi rapides. Pour étudier la cinétique de la chlorophylle in vivo avec une grande précision et une résolution spatio-temporelle dans les premières heures après la désétiolement induite par la lumière, un instrument et un protocole ont été développés. Nous présentons ici une procédure détaillée conçue pour une quantification statistiquement robuste de la chlorophylle dans les premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis .

Introduction

La désétiolation représente la phase la plus spectaculaire du cycle de vie des plantes, caractérisée par un certain nombre de changements morphologiques et un réarrangement complet du métabolisme des plantes (d’hétérotropique à autotropique)1. La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétioleation induite par la lumière chez les plantes et un processus très dynamique. La formation de chlorophylle à partir de protochlorophyllide précurseur produit à l’obscurité doit être étroitement coordonnée pour éviter les dommages dus aux sous-produits réactifs2. La réduction des protochlorophyllides en chlorophyllide est catalysée par des protochlorophyllides oxydoréductases (POR) dépendantes de la lumière, des enzymes uniques activées directement par la lumière. La réaction est très rapide, se déroulant de l’ordre de ms às 3, conduisant à une accumulation de chlorophylle reconnaissable en quelques minutes après l’irradiation des plantules étiolées 4,5,6. Il faut plus de temps (de quelques heures à quelques jours) pour que la biogenèse des chloroplastes établisse un appareil photosynthétique pleinement fonctionnel3.

Diverses méthodes existent pour analyser la teneur en chlorophylle, notamment la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou la spectrophotométrie. Habituellement, ces techniques exigent la destruction des tissus végétaux 4,5,6, limitant la détermination des changements dans les niveaux de chlorophylle au fil du temps. Les méthodes permettant l’établissement d’une cinétique de chlorophylle non invasive peuvent ouvrir une toute nouvelle perspective pour étudier les plantes sous divers aspects allant des questions de recherche fondamentale, telles que l’analyse du processus de synthèse de la chlorophylle dans le temps et l’espace, à des applications plus pratiques, telles que l’évaluation de la tolérance au stress ou l’effet des biostimulants sur la cinétique de la chlorophylle. Compte tenu de cela, nous avons introduit un système de surveillance de la formation de chlorophylle, iReenCAM7. Il intègre une caméra CCD, des filtres d’émission, des sources lumineuses et un pipeline pour l’analyse automatisée de la fluorescence (Figure 1). La principale caractéristique du dispositif développé est une résolution spatiale et temporelle élevée, surpassant les paramètres utilisés dans les approches actuelles, et une sensibilité et une spécificité suffisantes par rapport aux méthodes analytiques standard7.

La procédure non invasive décrite ici nécessite un minimum de réactifs et comprend des étapes simples, permettant d’obtenir un profil cinétique de chlorophylle chez des plantules vivantes d’Arabidopsis pendant les très premiers stades de la désétiole. Le protocole peut être utile pour l’étude d’un processus hautement dynamique de synthèse de la chlorophylle influencé par un certain nombre de facteurs, à la fois exogènes (sel, sécheresse, biostimulants, métaux lourds, etc.) et endogènes (généralement associés à des changements dans l’activité des gènes) d’origine sans qu’il soit nécessaire de détacher un tissu végétal, évitant ainsi un stress supplémentaire.

Protocol

1. Préparation moyenne Préparer le milieu de culture en mélangeant 0,75 g d’agent gélifiant avec 50 mL d’eau désionisée stérile dans une bouteille en verre pour obtenir une concentration de 1,5 % (p/v) pour une plaque de Petri (120 x 120 x 17 mm). Secouez doucement le mélange puis faites-le chauffer au micro-ondes jusqu’à ébullition pour dissoudre le gélifiant (la solution devient claire). Laissez le fluide refroidir à 58-60 °C avant de passer aux étapes suivantes….

Representative Results

La production typique obtenue à l’aide de la procédure nouvellement mise au point dans les semis d’Arabidopsis désétiolés âgés de 4 jours de type sauvage (WT), l’écotype Columbia-0 (Col-0) est illustrée à la figure 3. Dans des conditions de contrôle (milieu MS supplémenté en DMSO), la courbe de biosynthèse de la chlorophylle commence par une première poussée de la synthèse de la chlorophylle, dans laquelle le pool de protochlorphyllides synthétisé pendant la…

Discussion

Étapes critiques du protocole et du dépannage – pas de lumière et prendre soin du masque
Comme le souligne directement la description du protocole ci-dessus, il est d’une importance cruciale d’éviter même les traces de lumière pendant la culture des semis de plantes étiolées ou juste avant de commencer le protocole11. Dans notre installation, nous utilisons une chambre noire dédiée située dans le phytotron et séparée du reste du phytotron par une porte rotative…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Fonds européen de développement régional-Projet SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Ce projet a reçu un financement dans le cadre du projet MSCA4Ukraine (ID 1233580), qui est financé par l’Union européenne. Nous remercions Lenka Sochurkova pour la conception graphique de la figure 1.

Materials

6-benzylaminopurine Duchefa Biochemie B0904.0001
Aluminum foil Merck Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds NASC collection N1092
Cultivation chamber PSI custom made
Dimethilsulfoxid Thermo Fisher Scientific 042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) Merck EP3123000063
Gelrite Duchefa Biochemie G1101
iReenCAM device PSI custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL Merck Z305170-10EA
Laminar-flow box UniGreenScheme ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch 3M Science. Applied to Life 7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND Merck BR780546-500EA
Micropore tape 3M Science. Applied to Life 7100225115
Osram lumilux green l18w/66 Ovalamp 200008833
Petri plates – Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented Merck Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen Merck AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software PSI delivered as a part of the iReenCAM

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Citer Cet Article
Balakhonova, V., Pushkarova, N., Skalak, J., Dobisova, T., Benedikty, Z., Panzarova, K., Trtilek, M., Hejátko, J. Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation. J. Vis. Exp. (203), e66087, doi:10.3791/66087 (2024).

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