Immunoprécipitation avec un gel d’affinité anti-épitope pour étudier les interactions protéine-protéine
Summary
Les interactions protéine-protéine sont importantes pour élucider la fonction des protéines cibles, et la co-immunoprécipitation (co-IP) peut facilement confirmer les IPP. Nous avons transfecté transitoirement un plasmide codant pour une protéine marquée à un épitope dans des cellules HEK-293 et développé une méthode d’immunoprécipitation pour confirmer facilement la liaison de deux protéines cibles.
Abstract
Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central dans les phénomènes biologiques, tels que l’organisation cellulaire, la transduction du signal intracellulaire et la régulation transcriptionnelle. Par conséquent, la compréhension des IPP est un point de départ important pour une étude plus approfondie de la fonction de la protéine cible. Dans cette étude, nous proposons une méthode simple pour déterminer la liaison de deux protéines cibles en introduisant des vecteurs d’expression de mammifères dans les cellules HEK-293 à l’aide de la méthode de la polyéthylénimine, en lysant les cellules dans un tampon de lyse protéique fait maison et en tirant les protéines cibles sur un gel d’affinité de marquage d’épitope. De plus, l’IPP entre les différentes protéines fusionnées avec l’épitope peut être confirmée en utilisant des anticorps d’affinité contre chaque étiquette au lieu du gel d’affinité de l’épitope. Ce protocole pourrait également être utilisé pour vérifier divers IPP, y compris les extraits nucléaires, d’autres lignées cellulaires. Par conséquent, il peut être utilisé comme méthode de base dans une variété d’expériences IPP. Les protéines se dégradent en raison d’une longue période de temps et de cycles répétés de congélation-décongélation. Par conséquent, la lyse cellulaire, l’immunoprécipitation et l’immunotransfert doivent être effectués de manière aussi transparente que possible.
Introduction
Les protéines jouent un rôle majeur dans toutes les fonctions cellulaires, y compris le traitement de l’information, le métabolisme, le transport, la prise de décision et l’organisation structurelle. Les protéines médient leurs fonctions en interagissant physiquement avec d’autres molécules. Les interactions protéine-protéine (IPP) sont importantes pour la médiation des fonctions cellulaires, telles que la médiation de la transduction du signal, la détection de l’environnement, la conversion de l’énergie en mouvement physique, la régulation de l’activité des enzymes métaboliques et de signalisation et le maintien de l’organisation cellulaire1. Ainsi, les IPP peuvent être utilisés pour élucider des fonctions inconnues2. Les méthodes de détection des IPP peuvent être classées en trois types : in vitro, in vivo et in silico. La co-immunoprécipitation (co-IP), la chromatographie d’affinité, la purification d’affinité en tandem, les réseaux de protéines, l’affichage de phages, la complémentation de fragments de protéines, la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ont été utilisés pour la détection in vitro des IPP3. Parmi ces méthodes, la co-IP est largement utilisée en raison de sa simplicité.
L’étiquette de fusion FLAG se compose de huit acides aminés (AspTyrLysAspAspAspAspAspLys : DYKDDDDK), y compris un site de clivage de l’entérokinase, et a été spécialement conçue pour la chromatographie d’immunoaffinité4. Les protéines marquées DYKDDDDK sont reconnues et capturées à l’aide d’un anticorps anti-DYKDDDDK. Par conséquent, ils sont efficacement tirés vers le bas à l’aide de billes d’agarose de liaison DYKDDDDK5 pour confirmer leur liaison à des protéines spécifiques de manière simple. L’immunoprécipitation peut être réalisée dans une variété de cellules, et une large gamme d’IPP peut être confirmée à l’aide d’anticorps contre la protéine d’intérêt. L’immunoprécipitation et l’élution peptidique avec des billes d’agarose anti-DYKDDDDK ont déjà été signalées5.
Ici, nous proposons une méthode d’immunoprécipitation simple dans laquelle un plasmide codant pour une protéine marquée DYKDDDDK est introduit transitoirement dans les cellules HEK-293 pour confirmer l’association de deux protéines d’intérêt. Certains anticorps DYKDDDDK peuvent se lier à la fois à l’extrémité N-terminale et à l’extrémité C-terminale des protéines de fusion, mais pas à d’autres6. Par conséquent, pour éviter toute confusion, il faut choisir l’anticorps qui reconnaît l’étiquette fusionnée à l’extrémité N-terminale et à l’extrémité C-terminale. Lors de l’insertion d’un marqueur d’épitope, il peut être possible d’éviter les changements conformationnels dans la protéine en insérant 3 à 12 paires de bases entre l’étiquette d’épitope et la protéine cible. Cependant, la séquence insérée doit être une paire de base en multiples de 3 pour éviter le décalage d’image.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est presque comme les protocoles5, 7, 14, 15 précédemment rapportés. Le point important de ce protocole est que nous n’arrêtons jamais l’expérience de l’étape de lyse cellulaire à l’étape d’immunoprécipitation. La dégradation des protéines entrave la détection des IPP. L’allongement du temps et les cycles répétés de gel-dégel dégradent les protéines. L…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) numéro de subvention KAKENHI 19K18008 (G.N.), la subvention JSPS Kakenhi numéro 22K16415 (G.N.), la subvention JSPS Kakenhi numéro 22K08672 (H.O.), la subvention de recherche de la Société japonaise du diabète pour les jeunes chercheurs (G.N.) et la subvention de recherche de la Fondation MSD pour les sciences de la vie pour les jeunes chercheurs (G.N.).
Materials
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
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