Summary

Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

Ce protocole vise à évaluer les peptides biofonctionnels auto-assemblés pour l’adhésion cellulaire, la morphologie des organoïdes et l’expression génique par immunomarquage. Nous utiliserons une lignée cellulaire de cancer colorectal pour fournir un moyen rentable d’obtenir des organoïdes pour des tests intensifs.

Abstract

Les peptides ultracourts à s’assembler automatiquement (SAP) peuvent former spontanément des nanofibres qui ressemblent à la matrice extracellulaire. Ces fibres permettent la formation d’hydrogels biocompatibles, biodégradables et non immunogènes. Nous avons précédemment prouvé que les SAP, lorsqu’ils sont biofonctionnalisés avec des motifs dérivés de protéines, peuvent imiter les caractéristiques de la matrice extracellulaire qui soutiennent la formation d’organoïdes colorectaux. Ces hydrogels peptidiques biofonctionnels conservent les propriétés mécaniques, l’accordabilité et l’imprimabilité du peptide parent d’origine tout en incorporant des indices qui permettent aux interactions cellule-matrice d’augmenter l’adhésion cellulaire. Cet article présente les protocoles nécessaires pour évaluer et caractériser les effets de divers hydrogels peptidiques biofonctionnels sur l’adhésion cellulaire et la formation de lumière à l’aide d’une lignée cellulaire cancéreuse d’adénocarcinome capable de former des organoïdes de cancer colorectal de manière rentable. Ces protocoles permettront d’évaluer les effets de l’hydrogel peptidique biofonctionnel sur l’adhésion cellulaire et la formation luminale à l’aide de l’immunomarquage et de l’analyse d’images de fluorescence. La lignée cellulaire utilisée dans cette étude a déjà été utilisée pour générer des organoïdes dans des matrices dérivées d’animaux.

Introduction

Ces dernières années, les peptides auto-assemblés (SAP) sont apparus comme des biomatériaux prometteurs pour des applications d’ingénierie tissulaire. Les SAP possèdent des propriétés uniques, notamment la formation spontanée de nanofibres, la biocompatibilité, la biodégradabilité et la non-immunogénicité, ce qui en fait des candidats attrayants pour le développement d’échafaudages1. Les SAP ont déjà été utilisés avec divers types de cellules, et notamment, les SAP ultracourts ont facilité l’encapsulation des cellules souches tout en maintenant leur pluripotence sur des périodes prolongées englobant plus de 30 passages et avec une incidence minimale d’aberrations chromosomiques 2,3,4. Par conséquent, l’adaptation des PAS à leur utilisation en culture d’organoïdes a constitué une étape ultérieure rationnelle.

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles complexes qui résultent de cellules pluripotentes uniques. Ces structures donnent naissance à divers types de cellules, qui s’auto-organisent ensuite pour reproduire les processus de développement de la croissance embryonnaire et tissulaire in vitro5. Ce cadre innovant est devenu un formidable outil pour les investigations in vitro, conservant efficacement les attributs génétiques, phénotypiques et comportementaux caractéristiques des organes in vivo 6. Néanmoins, l’un des principaux obstacles à la transition du laboratoire au chevet des patients des résultats basés sur les organoïdes est la nécessité de reproductibilité7. Cette variation des résultats est principalement attribuée à la difficulté de différencier complètement les cellules souches pluripotentes humaines en lignées cellulaires spécialisées, aggravée par l’absence d’architecture tissulaire authentique et la complexité inhérente rencontrée dans les modèles organoïdes. Compte tenu de la popularité croissante des études basées sur des cellules souches et des organoïdes8, il y a eu une demande accrue de biomatériaux dotés de propriétés mécaniques dynamiques et de sites d’adhésion ou d’échafaudages similaires à ceux de l’intégrine à dégradabilité contrôlée 7,9. Ces attributs peuvent être ajustés efficacement grâce à l’utilisation stratégique de PAS biofonctionnalisés.

Les SAP sont de courtes séquences d’acides aminés ayant la capacité inhérente de s’organiser spontanément en structures bien définies10. Ces peptides contiennent souvent une alternance de résidus hydrophobes et hydrophiles, qui entraînent leur auto-assemblage par des interactions non covalentes, notamment les liaisons hydrogène, les interactions électrostatiques et les effets hydrophobes11,12. Le processus d’auto-assemblage de ces peptides est principalement motivé par la nécessité de minimiser l’énergie libre du système. Lorsqu’ils sont dans un environnement aqueux, les résidus hydrophobes ont tendance à se regrouper pour minimiser leur exposition à l’eau, tandis que les résidus hydrophiles interagissent avec les molécules d’eau environnantes. Ce phénomène conduit à la formation de diverses nanostructures. Dans ce cas, les peptides ultracourts auto-assemblés forment des nanofibres dont les caractéristiques dépendent de la séquence peptidique et des conditions environnementales 2,12,13,14,15,16. Ces peptides adoptent une conformation en β-tour, où les brins peptidiques individuels s’alignent parallèlement ou antiparallèlement les uns aux autres, stabilisés par des liaisons hydrogène (Figure 1). La présence d’ions positifs accélère les processus d’auto-assemblage qui conduisent à la formation de nanofibres.

Les nanofibres peptidiques ont été identifiées comme possédant une capacité innée à piéger des volumes importants d’eau. Cette caractéristique facilite la génération d’un hydrogel, qui se manifeste par la suite par un espace tridimensionnel biocompatible et biodégradable propice à la prolifération et à la croissance cellulaires. Ces nanofibres peptidiques auto-assemblées émulent de manière complexe les caractéristiques topographiques inhérentes à l’environnement de la matrice extracellulaire naturelle (MEC)1. Cette ressemblance dote les cellules d’un environnement qui imite leur habitat physiologique, favorisant ainsi des activités cellulaires optimales17. De plus, la polyvalence inhérente à ces peptides permet un degré considérable de réglage4. Une telle adaptabilité permet de modifier les propriétés de la matrice, telles que la rigidité, la cinétique de gélification et la porosité. Ces adaptations sont réalisées par des modifications de la séquence peptidique. Par conséquent, les peptides auto-assemblés (SAP) sont devenus des composants essentiels de la science contemporaine des biomatériaux, largement utilisés comme échafaudages pour la régénération des tissus et la culture cellulaire13,17.

L’un des avantages essentiels des peptides auto-assemblés est leur capacité à être facilement synthétisés et modifiés au niveau moléculaire. Cet avantage permet d’incorporer des groupes fonctionnels spécifiques ou des motifs bioactifs dans la séquence peptidique, ce qui permet de concevoir des peptides avec des propriétés et des fonctionnalités adaptées 18,19,20 (Figure 1B). Par exemple, les SAP biofonctionnalisés peuvent être conçus pour imiter l’ECM et favoriser la différenciation à l’aide du peptide RGD19,21. Il a également été rapporté que le peptide Ben-IKVAV augmente considérablement l’expression des marqueurs neuronaux spécifiques en raison de sa motiété spécifique au ligand22. Ces peptides peuvent également être modifiés pour afficher des molécules bioactives, telles que des peptides liant l’intégrine, afin d’améliorer la survie cellulaire23. Enfin, d’autres SAP biofonctionnalisés ont été développés pour favoriser l’angiogenèse en incluant les motifs IKVAV et YIGSR dans leurs structures24.

Les SAP biofonctionnalisés rapportés dans une publication antérieure montrent que l’auto-assemblage peut être davantage modifié en incluant le peptide naïf à partir duquel le SAP biofonctionnalisé a été dérivé25. Ces mélanges de SAP peuvent également fournir un large éventail de formulations de SAP dont l’activité biochimique et les propriétés physicochimiques varient. Par exemple, le peptide amphiphile IIFK est un SAP ultracourt qui peut résister à la biofonctionnalisation avec divers motifs, comme en témoigne l’incorporation du motif IKVAV (Figure 1B). Les deux peptides peuvent former des nanofibres, à la fois seules et combinées. Chaque formulation donne des hydrogels aux propriétés physiques variables (Figure 2)

Cependant, en raison de la vaste gamme de permutations et d’alternatives potentielles obtenues à partir de la biofonctionnalisation des PAS, il est nécessaire de fournir une option rapide et rentable pour les tests d’organoïdes. La lignée cellulaire SW1222, dérivée de l’adénocarcinome colorectal humain, est un candidat pour une évaluation aussi intensive et rentable des organoïdes26,27. Les cellules SW1222 possèdent des caractéristiques qui permettent leur agrégation en structures 3D ressemblant à des organoïdes, ce qui en fait un modèle idéal pour l’étude du développement tissulaire et des applications de la médecine régénérative. Les cellules SW1222 ont été identifiées comme capables de générer des organoïdes en raison de leur surexpression intrinsèque du gène LGR5 27. La création d’organoïdes à partir de cellules souches LGR5+ individuelles a déjà été démontrée de manière convaincante, ainsi que la propension des cellules SW1222 à obtenir les caractéristiques morphologiques d’un organoïde de cancer colorectal28.

Dans cet article méthodologique, nous présentons des protocoles détaillés pour évaluer et caractériser les effets de divers peptides biofonctionnels sur l’adhésion cellulaire et la formation de lumière à l’aide de cellules SW1222 (Figure 3). En fournissant des procédures étape par étape et des méthodes d’analyse d’imagerie, nous espérons offrir des informations précieuses sur la biofabrication des organoïdes et l’évaluation de matrices SAP simplistes pour la culture d’organoïdes.

Protocol

1. Préparation du tampon et de la solution REMARQUE : Toutes les concentrations indiquées sont des concentrations finales. Ajoutez du sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline-streptomycine à une concentration finale de 10 % et 1 %, respectivement, pour préparer le milieu Dulbecco’s modifié (IMDM) complet d’Iscove. Conserver à l’obscurité à 4 °C jusqu’à 1 mois. Mélangez du MgCl2 (3 mM), du saccharose (300 mM) et du Triton…

Representative Results

Tout d’abord, nous avons évalué les cellules cultivées dans une plaque à 24 puits pendant 7 jours à l’aide de l’imagerie en fond clair. Nous avons identifié de petits groupes de cellules s’assemblant en organoïdes au cours de la semaine, comme le montre la figure 4. Une méthode de balayage contrôlé permet de suivre la mobilité des cellules et des organoïdes entre différents jours. En général, nous avons regardé l’évolution de la morphologie des cellules pendant tou…

Discussion

Le vaste potentiel des PAS dans la recherche biomédicale est souligné par leur malléabilité et leur adaptabilité par biofonctionnalisation. Avec un tel éventail de permutations, le défi se pose de tester et de déterminer efficacement les configurations les plus prometteuses pour des applications spécifiques, en particulier dans la recherche sur les organoïdes. Une solution rapide et rentable est primordiale. La lignée cellulaire SW1222, dérivée de l’adénocarcinome colorectal humain, apparaît comme un can…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu financièrement par l’Université des sciences et de la technologie du roi Abdallah. Les auteurs remercient la subvention du fonds d’amorçage de KAUST et le fonds d’innovation de KAUST décerné par l’innovation et le développement économique de KAUST. Les auteurs tiennent à remercier les laboratoires de biosciences et d’imagerie de KAUST pour leur soutien à la caractérisation biologique et aux analyses de microscopie.

Materials

1x PBS Gibco 14190144
6-well plate, tissue culture treated Corning 07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium Gibco 70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific 28906
24-well plate, tissue culture treated Corning 09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated Corning 07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent Invitrogen DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal Abcam ab40839 Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal Abcam ab16505 Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal Abcam ab190085 Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA Sigma-Aldrich A9418
Cellpose 2.0 NA NA Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan ZEISS LSM 880
DAPI Invitrogen D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11055
Glycine Cytiva GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633 Invitrogen 35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS) Gibco 16140071
ImageJ 1.54f NIH NA
IMDM Gibco 12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Invitrogen L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O) Sigma-Aldrich M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free Corning 356255 Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS Thermo Scientific EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154 OriginLab Corp NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2) Lab-made NA Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2) Lab-made NA Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2) Lab-made NA Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin Invitrogen R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter VWR 631-0170
Scanning Electron Microscope Thermo Fisher – FEI TENEO VS
Sterile 30 μm strainer Sysmex 04-004-2326
sucrose Sigma-Aldrich S1888
SW1222 cell line ECACC 12022910
Triton x-100 Thermo Scientific 85111
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco 25200056
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
UltraPure water Invitrogen 10977015

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Citer Cet Article
Perez-Pedroza, R., Moretti, M., Hauser, C. A. E. Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self-Assembling Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (207), e66060, doi:10.3791/66060 (2024).

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