Summary

Modélisation de la chirurgie de la cataracte chez la souris

Published: December 01, 2023
doi:

Summary

Cette méthode modélise la chirurgie de la cataracte in vivo en retirant les cellules de fibre du cristallin de souris adultes et en laissant derrière elle le sac capsulaire avec les cellules épithéliales du cristallin (LEC) attachées. La réponse à la blessure est ensuite évaluée à divers moments postopératoires à l’aide de critères moléculaires et morphologiques.

Abstract

La chirurgie de la cataracte (CS) est un traitement efficace de la cataracte, une cause majeure de handicap visuel dans le monde. Cependant, la césarienne entraîne une inflammation oculaire et, à long terme, elle peut entraîner une opacification capsulaire postérieure (OCP) et/ou une luxation du cristallin due à la prolifération post-chirurgicale des cellules épithéliales du cristallin (LEC) et à leur conversion en myofibroblastes et/ou en cellules fibreuses aberrantes. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels la CS entraîne l’inflammation et la PCO sont encore obscurs car la plupart des modèles in vitro ne récapitulent pas la réponse de cicatrisation des LEC observées in vivo, tandis que les modèles animaux traditionnels de la chirurgie de la cataracte, tels que les lapins, ne permettent pas la manipulation génétique de l’expression des gènes pour tester les mécanismes. Récemment, notre laboratoire et d’autres ont utilisé avec succès des souris génétiquement modifiées pour étudier les mécanismes moléculaires qui entraînent l’induction de la signalisation pro-inflammatoire et de la transition épithéliale à mésenchymateuse LEC, ce qui a permis de mieux comprendre la pathogenèse du PCO. Ici, nous rapportons le protocole établi pour la modélisation de la chirurgie de la cataracte chez la souris, qui permet un profilage transcriptionnel robuste de la réponse des LEC à l’élimination des cellules de fibres du cristallin via le RNAseq, l’évaluation de l’expression des protéines par immunofluorescence semi-quantitative et l’utilisation d’outils de génétique de souris modernes pour tester la fonction des gènes dont on suppose qu’ils participent à la pathogenèse des séquelles aiguës comme l’inflammation ainsi qu’à la conversion ultérieure des LEC en myofibroblastes et/ou cellules de fibre de lentille aberrantes.

Introduction

Le cristallin est un tissu transparent très organisé qui réfracte la lumière pour produire une image clairement focalisée sur la rétine 1,2,3. Cet organe spécialisé est entouré d’une membrane basale ininterrompue (la capsule), qui isole le cristallin des autres parties de l’œil. La surface antérieure interne de la capsule ancre une monocouche de cellules épithéliales du cristallin (LEC), qui se différencient ensuite à l’équateur du cristallin en cellules de fibre du cristallin, qui constituent la grande majorité du cristallin3. Une cataracte se produit lorsque le cristallin perd sa transparence en raison de facteurs tels que le vieillissement, les mutations génétiques, les rayons UV, le stress oxydatif et les traumatismes oculaires4. La cataracte est l’une des principales causes de cécité dans le monde, en particulier dans les pays où les soins médicaux sont médiocres5. Cependant, cette affection est maintenant facilement traitée par l’ablation chirurgicale des cellules opaques du cristallin par phacoémulsification au cours de laquelle la capsule centrale du cristallin et l’épithélium du cristallin attaché sont retirés, suivie de l’utilisation d’une sonde vibrante pour briser la masse cellulaire du cristallin en fragments plus petits qui peuvent être aspirés ; laissant derrière lui un sac capsulaire avec quelques LEC équatoriaux attachés1. La vision est alors le plus souvent restaurée par l’implantation post-chirurgicale d’une lentille intraoculaire artificielle (LIO).

Bien que la chirurgie de la cataracte (CS) soit un traitement très efficace et peu invasif de la cataracte, la récupération post-chirurgicale d’un patient peut être gravement entravée par le développement d’une inflammation oculaire 5,6,8. Cette inflammation peut provoquer des douleurs post-chirurgicales, un œdème rétinien conduisant à un décollement de la rétine, ainsi que l’exacerbation d’autres affections inflammatoires et fibrotiques comme l’uvéite et le glaucome 4,7,8,9. L’inflammation oculaire post-CS (PCS) est généralement traitée avec des gouttes ophtalmiques anti-inflammatoires, qui sont en proie à une mauvaise observance du patient ou à une chirurgie de la cataracte sans goutte qui peut entraîner une prévalence accrue de corps flottants 8,10,11. À long terme, les résultats de la césarienne peuvent être compromis par le développement d’une opacification capsulaire postérieure (OCP)12. L’OCP se produit lorsque les LEC résiduels laissés après la chirurgie subissent une réponse de cicatrisation, prolifèrent et migrent sur la capsule postérieure du cristallin pendant des mois ou des années, contribuant ainsi à une obstruction visuelle secondaire13,14.

Comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels la CS entraîne de telles réponses aiguës et chroniques représente un défi majeur dans le domaine, car une grande partie de la littérature sur le PCO repose sur l’induction de la conversion de la LEC en myofibroblastes en culture via un traitement avec le facteur de croissance transformant actif bêta (TGFβ)12,15. Les modèles de sacs capsulaires humains créés à partir de lentilles de cadavres cultivées in vitro reflètent mieux la biologie du PCS du cristallin, car les LEC sont cultivés sur leur membrane basale native, mais sont difficiles à manipuler mécaniquement, ne récapitulent pas l’environnement intraoculaire et sont intrinsèquement variables en raison de la variabilité du cristallin à l’autre (ou du donneur au donneur)16,17. Des modèles in vivo de chirurgie de la cataracte chez le lapin 1,18 et le primate non humain19,20 surmontent certains de ces problèmes, mais ne sont toujours pas faciles à manipuler pour des études mécanistes. Notamment, une étude antérieure sur la régénération du cristallin chez les mammifères a révélé une régénération significative du cristallin dans les quatre semaines suivant le retrait des cellules de la fibre du cristallin chez la souris, laissant derrière elles les cellules épithéliales et la capsule du cristallin, tandis qu’aucune repousse du cristallin ne s’est produite lorsque le cristallin entier a été retiré21,22. Par la suite, nous avons rationalisé cette procédure et l’avons optimisée pour l’étude de la réponse aiguë des LEC à l’élimination des cellules de fibres du cristallin et de leur conversion ultérieure en une population mixte de cellules ayant des propriétés de myofibroblastes et de cellules de fibres. 

En utilisant ce modèle murin de chirurgie de la cataracte, nous avons montré que les cellules épithéliales du cristallin remodèlent drastiquement leur transcriptome en 6 heures PCS pour produire de nombreuses cytokines pro-inflammatoires23, tandis qu’elles commencent à exprimer des marqueurs fibrotiques dès 24 h PCS 12,23, avant le début de la signalisation canonique TGFβ. Des expériences mécanistes sur des souris knock-out utilisant ce modèle ont révélé que l’expression cellulaire de la fibronectine par les LEC est nécessaire pour une réponse fibrotique soutenue PCS, probablement en raison de son rôle dans l’assemblage de l’ECM fibreux et de la signalisation cellulaire12. D’autres études ont montré que l’intégrine αVβ8 est nécessaire à la transition des LEC vers les myofibroblastes en raison de sa fonction dans l’activation du TGFβ, et le potentiel de cette approche pour identifier les pistes thérapeutiques anti-PCO a été confirmé car un antagoniste de l’intégrine αVβ8 a également bloqué la LEC EMT15.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé décrivant comment retirer les cellules de la fibre du cristallin des souris vivantes (Figure 1et Figure 4) tout en laissant derrière la capsule du cristallin et les LEC pour modéliser la réponse du LEC à la chirurgie de la cataracte.

Protocol

Le protocole suivant a été approuvé par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Delaware en vertu du protocole #1039-2021-1. Conformément à l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle24, toutes les chirurgies de survie oculaire ne peuvent être pratiquées que dans un seul œil. Voir la Table des ma…

Representative Results

Sur la base des résultats de cette méthode chirurgicale, le laboratoire Duncan a utilisé ce modèle murin de chirurgie de la cataracte pour construire un temps de réponse aux lésions des cellules épithéliales du cristallin après la chirurgie (Figure 5). 6 heures après la chirurgie, 5 % du transcriptome épithélial du cristallin est exprimé de manière différentielle (Figure 6A), y compris la régulation positive de n…

Discussion

Cette technique chirurgicale nécessite une manipulation avancée des souris et des compétences microchirurgicales qui nécessitent de la pratique pour être développées. Le plus difficile à maîtriser est la mise en place de fines sutures dans la cornée pour fermer la plaie. Supposons que l’expérimentateur soit un novice total en matière de suture. Dans ce cas, il est recommandé de s’entraîner d’abord à l’aide de ficelle et de tissu, puis de s’entraîner à l’utili…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (EY015279 et EY028597) et Delaware INBRE (P20 GM103446).

Materials

0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP Baush Lomb 24208-910-55
1% Atropine sulfate ophthalmic solution Amneal 60219-1748-2
1% Tropicamide opthalmic solution USP Akorn 17478-102-12
10-0 Nylon suture Ethicon 7707G
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP Akorn 17478-200-12
26 G 1/2 Needles – straight BD PrecisionGlide 5111
27 G 45° bent dispensing tip 1" Harfington
Balanced saline solution Phoenix 57319-555-06
Bupranorphine (0.1 mg/kg) APP Pharmaceticals 401730D
Chlorhexidine solution
Needle holder 2-110 Duckworth & Kent 2-110-3E
Noyes scissors, straight Fine Science Tools 12060-02
SMZ800 Nikon model microscope Nikon
Sterile disposable scalpel No.11 Feather 2975#11
Tweezers #5 Dumont Electron Microscopy Sciences 72700-D
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution APP Pharmaceticals 401730D

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Citer Cet Article
O’Neill, L. M., Wang, Y., Duncan, M. K. Modeling Cataract Surgery in Mice. J. Vis. Exp. (202), e66050, doi:10.3791/66050 (2023).

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