Agro-infiltration forcée sous vide pour la transformation in planta de plantes récalcitrantes : le cacao comme étude de cas

Les méthodes de transformation génétique végétale sont essentielles pour tester les fonctions biologiques des gènes et sont particulièrement utiles aujourd’hui compte tenu du grand nombre de gènes non caractérisés prédits dans l’ère post-génomique¹. Ces méthodes peuvent être utilisées pour obtenir des lignées entièrement transformées ou pour exprimer des gènes de manière transitoire. La transformation stable se produit lorsque l’ADN étranger que l’hôte a absorbé s’intègre complètement et irréversiblement dans le génome de l’hôte, et que les modifications génétiques sont transmises aux générations suivantes. L’expression transitoire, connue sous le nom de transformation transitoire, se produit à partir des multiples copies d’ADN-T transférées par Agrobacterium dans la cellule, qui n’ont pas été intégrées dans le génome de l’hôte, et atteint son apogée 2 à 4 jours après l’infection².

Il convient de noter que les tests d’expression transitoire sont souvent suffisants pour la caractérisation fonctionnelle des gènes et peuvent offrir plusieurs avantages par rapport à la transformation stable. Par exemple, la transformation transitoire ne nécessite pas de procédures de régénération basées sur la culture tissulaire. Un autre avantage est qu’il est compatible avec l’analyse fonctionnelle in planta des gènes, existant plusieurs exemples réussis de protocoles bien standardisés pour des espèces végétales modèles, telles que Arabidopsis thaliana³ et Nicotiana benthamiana⁴, mais encore limité chez les espèces non modèles⁵.

Le développement de tests transitoires repose sur la disponibilité de méthodes efficaces de transfert de gènes. Pour cela, les approches les plus populaires sont basées sur l’infiltration d’Agrobacterium , qui tire parti de la capacité unique d’Agrobacterium à transférer l’ADN aux cellules végétales ⁶. Un autre outil utile pour ces analyses est l’utilisation de gènes rapporteurs, tels que les protéines fluorescentes vertes (GFP), la β-glucuronidase (GUS), la luciférase ou RUBY, qui sont tous utilisés pour suivre les événements de transformation. Parmi ces systèmes rapporteurs, RUBY est actuellement le plus facile à visualiser et repose sur la conversion de la tyrosine en bétalaïnes par trois réactions enzymatiques. Contrairement à d’autres systèmes rapporteurs, les bétalaïnes résultantes peuvent être facilement observées sous forme de pigments de couleurs vives sur des tissus végétaux transformés sans avoir besoin d’équipement sophistiqué ou de réactifs supplémentaires⁷.

Lors de l’infiltration d’une suspension d’Agrobacterium dans l’espace intercellulaire du mésophylle des feuilles, l’étape la plus critique pour une agro-infection réussie consiste à surmonter la barrière physique imposée par la cuticule épidermique des feuilles⁸. Alors que pour certaines plantes, un gradient de pression créé avec une seringue sans aiguille (seringue Agroinfiltration) est suffisant pour une agro-infiltration efficace, comme c’est le cas chez Nicotiana benthamiana⁹, d’autres espèces végétales peuvent nécessiter un gradient de pression plus important comme celui créé à l’aide de pompes à vide¹⁰. Dans les procédés assistés par le vide, l’agro-infiltration se fait en deux étapes. Dans le premier, le vide sert à soumettre la matière végétale à une pression réduite, forçant la libération de gaz des espaces aériens du mésophylle à travers les stomates et les plaies. Puis, lors d’une phase de repressurisation, la suspension d’Agrobacterium s’infiltre dans les espaces intercellulaires via les stomates et blesse¹¹.

Par rapport à l’infiltration par seringue, l’infiltration sous vide permet une fréquence d’utilisation plus élevée, une répétabilité et la possibilité de contrôler la pression et la durée à chaque étape du processus d’infiltration¹⁰. Dans les feuilles de différentes espèces végétales telles que l’épinard (Spinacia oleracea)¹², la pivoine (une plante vivace ligneuse) (Paeonia ostii)¹³ et le niébé (Vigna unguiculata)¹⁴, les protocoles d’agroinfiltration sous vide ont permis d’obtenir un taux d’infiltration plus profond que l’infiltration à la seringue. De même, chez la tomate (Lycopersicon esculentum)¹⁵ et le gerbera (Gerbera hybrida)¹⁶, l’agro-infiltration sous vide a produit un silençage génique plus fort et plus uniforme que l’infiltration à la seringue. Un autre avantage de l’infiltration sous vide est la moindre dépendance au génotype, par rapport à l’infiltration à la seringue, qui a été observée récemment chez trois variétés d’agrumes (Fortunella obovata, Citrus limon et C. grandis)¹⁷. Cependant, lorsque vous essayez d’appliquer l’agro-infiltration sous vide à des plantes trop grandes pour tenir dans des dessiccateurs, la taille des chambres à vide peut être une limitation, comme c’est généralement le cas avec les plantes ligneuses tropicales.

Ci-dessous, nous décrivons un protocole qui surmonte la limitation spatiale des chambres à vide, en testant son utilité pour la transformation transitoire in planta des feuilles de cacao. Nous présentons la première méthode d’infiltration sous vide localisée pour le cacao, qui ne nécessite pas d’équipement supplémentaire et permet même l’utilisation des mêmes dessiccateurs de laboratoire que ceux utilisés pour l’infiltration de l’ensemble de la plante, mais avec une adaptation simple qui permet l’accès d’une partie de la plante à l’intérieur de la chambre à vide, permettant son utilisation à différents stades du développement de la plante. Pour tester l’utilité de la méthode d’infiltration sous vide localisée proposée, nous avons sélectionné le cacao comme proxy d’une espèce végétale tropicale à grandes feuilles difficile à transformer. En utilisant cette méthode d’infiltration localisée, nous avons récemment rapporté la première expression transitoire in planta chez l’avocat par infiltration sous vide médiée par Agrobacterium avec des conditions précédemment optimisées pour les feuilles détachées¹⁸, et ici nous rapportons la première expression transitoire in planta dans le cacao.