Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie
Summary
De toepassing van steunlagen op cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM)-roosters kan de deeltjesdichtheid verhogen, interacties met de lucht-waterinterface beperken, door bundels geïnduceerde beweging verminderen en de verdeling van deeltjesoriëntaties verbeteren. Dit artikel beschrijft een robuust protocol voor het coaten van cryoEM-roosters met een monolaag grafeen voor een betere voorbereiding van cryomonsters.
Abstract
Bij cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM) worden gezuiverde macromoleculen aangebracht op een rooster met een holle koolstoffolie; De moleculen worden vervolgens gedept om overtollige vloeistof te verwijderen en snel ingevroren in een ongeveer 20-100 nm dikke laag glasachtig ijs, opgehangen in ongeveer 1 μm brede foliegaten. Het resulterende monster wordt afgebeeld met behulp van cryogene transmissie-elektronenmicroscopie en na beeldverwerking met behulp van geschikte software kunnen structuren met bijna-atomaire resolutie worden bepaald. Ondanks de wijdverbreide acceptatie van cryoEM blijft monstervoorbereiding een ernstig knelpunt in cryoEM-workflows, waarbij gebruikers vaak uitdagingen tegenkomen in verband met monsters die zich slecht gedragen in het zwevende glasvocht. Onlangs zijn methoden ontwikkeld om cryoEM-roosters aan te passen met een enkele continue laag grafeen, die fungeert als een ondersteunend oppervlak dat vaak de deeltjesdichtheid in het afgebeelde gebied verhoogt en interacties tussen deeltjes en de lucht-waterinterface kan verminderen. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor de toepassing van grafeen op cryoEM-roosters en voor het snel beoordelen van de relatieve hydrofiliciteit van de resulterende roosters. Daarnaast beschrijven we een op EM gebaseerde methode om de aanwezigheid van grafeen te bevestigen door het karakteristieke diffractiepatroon te visualiseren. Ten slotte demonstreren we het nut van deze grafeenondersteuningen door snel een dichtheidskaart met een resolutie van 2,7 Å van een Cas9-complex te reconstrueren met behulp van een zuiver monster met een relatief lage concentratie.
Introduction
Cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) is geëvolueerd tot een veelgebruikte methode voor het visualiseren van biologische macromoleculen1. Gevoed door vooruitgang in directe elektronendetectie 2,3,4, data-acquisitie5 en beeldverwerkingsalgoritmen 6,7,8,9,10, is cryoEM nu in staat om 3D-structuren met een bijna-atomaire resolutie te produceren van een snelgroeiend aantal macromoleculen11. Bovendien kunnen gebruikers, door gebruik te maken van het enkelvoudige molecuulkarakter van de benadering, meerdere structuren bepalen uit een enkel monster 12,13,14,15, wat de belofte benadrukt van het gebruik van de gegenereerde gegevens om heterogene structurele ensembles te begrijpen 16,17. Ondanks deze vooruitgang blijven er knelpunten bestaan bij de voorbereiding van het cryo-samplerooster.
Voor structurele karakterisering door cryoEM moeten biologische monsters goed worden gedispergeerd in een waterige oplossing en vervolgens snel worden ingevroren via een proces dat vitrificatie18,19 wordt genoemd. Het doel is om deeltjes op te vangen in een uniform dunne laag verglaasd ijs die in gaten op regelmatige afstand van elkaar hangt en die meestal in een laag amorfe koolstof worden gesneden. Deze amorfe koolstoffolie met patroon wordt ondersteund door een TEM-raster met een gaas van koperen of gouden steunbalken. In standaardworkflows worden roosters hydrofiel gemaakt met behulp van een gloei-ontladingsplasmabehandeling voorafgaand aan de toepassing van het monster. Overtollige vloeistof wordt gedept met filtreerpapier, waardoor de eiwitoplossing een dunne vloeibare film over de gaten kan vormen die gemakkelijk kan worden verglaasd tijdens het invriezen. Veel voorkomende uitdagingen zijn onder meer de lokalisatie van deeltjes op het lucht-watergrensvlak (AWI) en de daaropvolgende denaturatie20,21,22 of het aannemen van voorkeursoriëntaties 23,24,25, het hechten van deeltjes aan de koolstoffolie in plaats van in de gaten te migreren, en clustering en aggregatie van de deeltjes in de gaten 26. Niet-uniforme ijsdikte is een ander punt van zorg; Dik ijs kan leiden tot hogere niveaus van achtergrondruis in de microfoto’s als gevolg van verhoogde elektronenverstrooiing, terwijl extreem dun ijs grotere deeltjes kan uitsluiten27.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, is een verscheidenheid aan dunne steunfolies gebruikt om roosteroppervlakken te coaten, waardoor deeltjes op deze steunen kunnen rusten en, idealiter, interacties met het lucht-watergrensvlak worden vermeden. Grafeensteunen zijn veelbelovend gebleken, deels vanwege hun hoge mechanische sterkte in combinatie met hun minimale verstrooiingsdoorsnede, waardoor het achtergrondsignaal dat door de ondersteuningslaag wordt toegevoegd, wordt verminderd28. Naast de minimale bijdrage aan achtergrondgeluid, vertoont grafeen ook een opmerkelijke elektrische en thermische geleidbaarheid29. Van met grafeen en grafeenoxide beklede roosters is aangetoond dat ze een hogere deeltjesdichtheid, een meer uniforme deeltjesverdeling30 en een verminderde lokalisatie van de AWI22 opleveren. Bovendien biedt grafeen een steunoppervlak dat verder kan worden aangepast om: 1) de fysiochemische eigenschappen van het rasteroppervlak af te stemmen door functionalisering 31,32,33; of 2) koppelbindmiddelen die de affiniteitszuivering van interessante eiwitten vergemakkelijken 34,35,36.
In dit artikel hebben we een bestaande procedure aangepast voor het coaten van cryoEM-roosters met een enkele uniforme laag grafeen30. De aanpassingen zijn bedoeld om de verwerking van het net in het hele protocol tot een minimum te beperken, met als doel de opbrengst en reproduceerbaarheid te verhogen. Daarnaast bespreken we onze aanpak om de werkzaamheid van verschillende UV/ozonbehandelingen te evalueren bij het hydrofiel maken van roosters voorafgaand aan het dompelen. Deze stap in de voorbereiding van cryoEM-monsters met behulp van met grafeen gecoate roosters is van cruciaal belang, en we hebben gemerkt dat onze eenvoudige methode om de relatieve hydrofiliciteit van de resulterende roosters te kwantificeren nuttig is. Met behulp van dit protocol demonstreren we het nut van het gebruik van met grafeen gecoate roosters voor structuurbepaling door een 3D-reconstructie met hoge resolutie te genereren van katalytisch inactieve S. pyogenes Cas9 in complex met gids-RNA en doel-DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
De voorbereiding van cryoEM-monsters brengt een groot aantal technische uitdagingen met zich mee, waarbij de meeste workflows vereisen dat onderzoekers fragiele roosters handmatig en uiterst voorzichtig manipuleren om beschadiging te voorkomen. Bovendien is de ontvankelijkheid van een monster voor vitrificatie onvoorspelbaar; Deeltjes interageren vaak met het lucht-water-grensvlak of met de stevige steunfolie die de roosters bedekt, wat ertoe kan leiden dat deeltjes de voorkeursoriëntatie aannemen of niet in de beeldvor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Specimens werden geprepareerd en afgebeeld in de CryoEM-faciliteit in MIT.nano op microscopen die waren verkregen dankzij de Arnold en Mabel Beckman Foundation. Beeldvormingsapparaten voor contacthoeken werden geprint in de MIT Metropolis Maker Space. We danken de laboratoria van Nieng Yan en Yimo Han en het personeel van MIT.nano voor hun steun tijdens de invoering van deze methode. In het bijzonder willen we Drs. Guanhui Gao en Sarah Sterling bedanken voor hun inzichtelijke discussies en feedback. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01-GM144542, 5T32-GM007287 en NSF-CAREER-subsidie 2046778. Onderzoek in het Davis-lab wordt ondersteund door de Alfred P. Sloan Foundation, het James H. Ferry Fund, de MIT J-Clinic en de Whitehead Family.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
- Dubochet, J. Cryo-EM–the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
