Summary

Isolement en une seule étape de vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de grand volume avec un dispositif microfluidique A4F bifurqué

Published: February 02, 2024
doi:

Summary

Les vésicules extracellulaires sont extrêmement prometteuses pour les applications biomédicales, mais les méthodes d’isolement actuelles prennent du temps et ne sont pas pratiques pour une utilisation clinique. Dans cette étude, nous présentons un dispositif microfluidique qui permet d’isoler directement des vésicules extracellulaires à partir de grands volumes de biofluides de manière continue avec un minimum d’étapes.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (VE) présentent un immense potentiel pour diverses applications biomédicales, notamment le diagnostic, l’administration de médicaments et la médecine régénérative. Néanmoins, les méthodologies actuelles d’isolement des VE présentent des défis importants, tels que la complexité, la consommation de temps et le besoin d’équipements encombrants, ce qui entrave leur application clinique. Pour remédier à ces limitations, nous avons cherché à développer un système microfluidique innovant basé sur le copolymère d’oléfines cycliques hors stœchiométrie thiol-ène (COC-OSTE) pour l’isolement efficace des VE à partir d’échantillons de grand volume de manière continue. En utilisant la séparation basée sur la taille et la flottabilité, la technologie utilisée dans cette étude a permis d’obtenir une distribution granulométrique nettement plus étroite par rapport aux approches existantes à partir d’échantillons d’urine et de milieux cellulaires, permettant de cibler des fractions de taille spécifiques des VE dans les applications futures. Notre conception innovante de dispositif microfluidique COC-OSTE, utilisant une technologie de fractionnement de champ à flux asymétrique bifurquée, offre une approche simple et continue d’isolation EV pour les échantillons de grand volume. De plus, le potentiel de fabrication de masse de ce dispositif microfluidique offre évolutivité et cohérence, ce qui permet d’intégrer l’isolation des VE dans les diagnostics cliniques de routine et les processus industriels, où une cohérence et un débit élevés sont des exigences essentielles.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules membranaires dérivées de cellules comprenant deux types principaux : les exosomes (30-200 nm) et les microvésicules (200-1000 nm)1. Les exosomes se forment par bourgeonnement vers l’intérieur de la membrane endosomale dans un corps multivésiculaire (MVB), libérant des vésicules intraluminales (ILV) dans l’espace extracellulaire lors de la fusion avec la membrane plasmique1. En revanche, les microvésicules sont générées par le bourgeonnement vers l’extérieur et la fission de la membrane cellulaire2. Les VE jouent un rôle crucial dans la communication intercellulaire en transportant des protéines, des acides nucléiques, des lipides et des métabolites, reflétant l’état physiologique de la cellule, y compris la croissance, l’angiogenèse, les métastases, la prolifération et la résistance auxthérapies 3. En conséquence, ils sont apparus comme des biomarqueurs prometteurs et des cibles thérapeutiques pour des maladies, y compris le cancer, soulignant leur potentiel dans les systèmes de diagnostic et d’administration de médicaments4.

Pour utiliser pleinement les VE dans le diagnostic et la thérapeutique des maladies, il est crucial d’isoler efficacement divers biofluides5. Les méthodes courantes comprennent l’ultracentrifugation (UC), la centrifugation par gradient de densité, la chromatographie d’exclusion stérique (SEC), la filtration et l’immuno-isolement6. La CU est une technique largement utilisée, mais elle peut produire des particules de densité similaire qui ne sont pas des VE et peuvent générer des agrégats de VE7. La SEC a gagné en popularité en raison de sa capacité à fournir des échantillons de plus grande pureté en excluant les particules en fonction de leur taille plutôt que de leur densité8. Cependant, une sélection minutieuse de la taille de pores appropriée pour la colonne SEC et l’optimisation des conditions de chromatographie sont essentielles pour minimiser le co-isolement des particules indésirables comme les chylomicrons et les lipoprotéines de basse densité8. Malgré leur efficacité, les deux méthodes sont longues et difficiles à automatiser, en particulier pour les échantillons de plus grand volume comme les milieux cellulaires ou l’urine, ce qui limite leur évolutivité pour les applications industrielles9.

Ces dernières années, le fractionnement asymétrique du champ d’écoulement (A4F) a évolué comme une technique de séparation puissante pour la séparation de particules de taille micro et nanométrique basée sur la taille et la flottabilité10. Le principe de fonctionnement d’A4F repose sur un canal microfluidique doté d’une membrane poreuse à sa base, générant une force exercée vers la membrane appelée tangentiel10. Lorsqu’il est combiné avec le mouvement brownien et l’écoulement de Poiseuille inhérents au système, le flux croisé facilite une séparation efficace des particules en raison de la variation de la position des particules dans la dynamique de l’écoulement11. Malgré les avantages, cette méthode est limitée à des volumes d’échantillons de l’ordre de12 microlitres et nécessite une étape de focalisation supplémentaire, prolongeant la durée du processus10.

Au cours de la dernière décennie, la microfluidique a pris de l’importance en tant qu’outil de séparation rapide, efficace et cliniquement fiabledes VE 13. Cependant, la plupart des méthodes microfluidiques conçues pour la séparation des VE sont optimisées pour les échantillons de VE de petit volume et à forte concentration ou dépendent de procédures de séparation complexes14. De plus, dans le domaine de la microfluidique, le polydiméthylsiloxane (PDMS) est reconnu comme le matériau de référence en raison de sa transparence optique, de sa biocompatibilité et de sa facilité d’utilisation15. Néanmoins, sa propension connue à absorber de petites molécules lipophiles, dont les VE, peut être problématique pour son application dans le domaine desVE13.

Le copolymère d’oléfine cyclique (COC) est un matériau fréquemment utilisé en microfluidique en raison de sa biocompatibilité, de sa faible absorption des molécules et de sa résistance chimique élevée15. Cependant, la fabrication de dispositifs COC implique souvent des processus complexes ou des équipements spécialisés16. Par ailleurs, le thiol-ène hors stœchiométrie (OSTE) est une alternative prometteuse au PDMS en raison de la diminution de l’absorption des petites molécules, de la stabilité chimique supérieure, de la facilité de fabrication et du processus de fabrication évolutif17,18. Cependant, en raison des connexions complexes aux tubes, les appareils peuvent être sujets à des fuites19.

L’objectif de cette étude était de concevoir et de fabriquer un dispositif microfluidique combinant OSTE et COC et le principe A4F bifurqué pour la séparation des VE à partir d’échantillons de grand volume tels que l’urine ou les milieux cellulaires.

Protocol

Le prélèvement d’échantillons a été approuvé par le Comité d’éthique de la vie et de la recherche en sciences médicales de l’Université lettone (décision N0-71-35/54) NOTE : Les matériaux utilisés dans cette étude sont inclus dans le fichier de la table des matériaux . 1. Fabrication de moules imprimés en trois dimensions (3D) Concevez un moule double négatif en forme de serpentin dans un logiciel de…

Representative Results

Nous avons fabriqué un dispositif microfluidique à l’aide d’un moule double négatif imprimé en 3D (Figure 1) par lithographie douce (Figure 2A) pour une séparation à haut débit des VE basée sur le principe A4F bifurqué (Figure 2B,C). L’installation nécessite une pompe et une station de circulation, comme on peut le voir sur la figure 3, pour isoler les véhicules électr…

Discussion

Le dispositif microfluidique présenté offre une méthode prometteuse pour l’isolement et l’extraction des VE à partir de fluides biologiques, remédiant à certaines des limites critiques des méthodes de référence existantes telles que UC et SEC12. L’UC et le SEC sont connus pour être à forte intensité de main-d’œuvre, de temps et de faible rendement, ce qui les rend moins adaptés aux applications à haut débit où de grandes quantités de VE sont nécessaires

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions tous les donneurs qui ont participé à cette étude, le personnel de la base de données génomique lettone pour avoir fourni les échantillons. L’Institut de physique des solides de l’Université de Lettonie en tant que centre d’excellence a reçu un financement du programme-cadre Horizon 2020 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 739508, projet CAMART2. Ce travail a été soutenu par le Conseil letton des sciences Projet No. lzp-2019/1-0142 et le projet no : lzp-2022/1-0373.

Materials

0.1 µm carboxylate FluoSpheres Invitrogen #F8803 Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubes Starstedt 72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needle RAYS TUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheres Invitrogen #F13083 Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettes Sarstedt 86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters Merck Millipore UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes Eppendorf 30108132
20 mL syringes BD PlastikPak 10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubing Darwin Microfluidics CIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter units Merck Millipore, UFC200324
5 mL Medical Syringe without Needle Anhui Hongyu Wuzhou Medical 159646
50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing Darwin Microfluidics LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding Greiner Bio-One 655001 ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine serum albumin SigmaAldrich A7906-100G
COC Topas microscopy slide platform Microfluidic Chipshop 10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer  Microfluidic Chipshop 10000387
Elveflow OB1 pressure controller Elvesys Group
Luer connectors Darwin Microfluidics  CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6 SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250 Thinky Corporation
NanoSight NS300 Malvern Panalytical NS300 nanoparticle analyzer 
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g Fisher Scientific BP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterile Sarstedt 82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm column Izon SP5 SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit PP&S
Resin Tough Black Zortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 331301
Syringe pump DK Infusetek ISPLab002
T175 suspension flask Sarstedt 83.3912.502
TIM4-Fc protein Adipogen LifeSciences AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) SigmaAldrich T0440-100ML Horseradish peroxidase substrate
Tween20 SigmaAldrich P1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XP Beckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 H Elma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate Spectrophotometer Bio-Tek instruments 71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterile APTACA 2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe Filter SigmaAldrich 68092002
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical dynamic light scattering (DLS) system 
Zortrax Inkspire Zortrax

References

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Citer Cet Article
Priedols, M., Paidere, G., Kaukis, P., Bajo-Santos, C., Spule, A., Miscenko, A., Mozolevskis, G., Rimsa, R., Abols, A. Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (204), e66019, doi:10.3791/66019 (2024).

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