Les vésicules extracellulaires sont extrêmement prometteuses pour les applications biomédicales, mais les méthodes d’isolement actuelles prennent du temps et ne sont pas pratiques pour une utilisation clinique. Dans cette étude, nous présentons un dispositif microfluidique qui permet d’isoler directement des vésicules extracellulaires à partir de grands volumes de biofluides de manière continue avec un minimum d’étapes.
Les vésicules extracellulaires (VE) présentent un immense potentiel pour diverses applications biomédicales, notamment le diagnostic, l’administration de médicaments et la médecine régénérative. Néanmoins, les méthodologies actuelles d’isolement des VE présentent des défis importants, tels que la complexité, la consommation de temps et le besoin d’équipements encombrants, ce qui entrave leur application clinique. Pour remédier à ces limitations, nous avons cherché à développer un système microfluidique innovant basé sur le copolymère d’oléfines cycliques hors stœchiométrie thiol-ène (COC-OSTE) pour l’isolement efficace des VE à partir d’échantillons de grand volume de manière continue. En utilisant la séparation basée sur la taille et la flottabilité, la technologie utilisée dans cette étude a permis d’obtenir une distribution granulométrique nettement plus étroite par rapport aux approches existantes à partir d’échantillons d’urine et de milieux cellulaires, permettant de cibler des fractions de taille spécifiques des VE dans les applications futures. Notre conception innovante de dispositif microfluidique COC-OSTE, utilisant une technologie de fractionnement de champ à flux asymétrique bifurquée, offre une approche simple et continue d’isolation EV pour les échantillons de grand volume. De plus, le potentiel de fabrication de masse de ce dispositif microfluidique offre évolutivité et cohérence, ce qui permet d’intégrer l’isolation des VE dans les diagnostics cliniques de routine et les processus industriels, où une cohérence et un débit élevés sont des exigences essentielles.
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules membranaires dérivées de cellules comprenant deux types principaux : les exosomes (30-200 nm) et les microvésicules (200-1000 nm)1. Les exosomes se forment par bourgeonnement vers l’intérieur de la membrane endosomale dans un corps multivésiculaire (MVB), libérant des vésicules intraluminales (ILV) dans l’espace extracellulaire lors de la fusion avec la membrane plasmique1. En revanche, les microvésicules sont générées par le bourgeonnement vers l’extérieur et la fission de la membrane cellulaire2. Les VE jouent un rôle crucial dans la communication intercellulaire en transportant des protéines, des acides nucléiques, des lipides et des métabolites, reflétant l’état physiologique de la cellule, y compris la croissance, l’angiogenèse, les métastases, la prolifération et la résistance auxthérapies 3. En conséquence, ils sont apparus comme des biomarqueurs prometteurs et des cibles thérapeutiques pour des maladies, y compris le cancer, soulignant leur potentiel dans les systèmes de diagnostic et d’administration de médicaments4.
Pour utiliser pleinement les VE dans le diagnostic et la thérapeutique des maladies, il est crucial d’isoler efficacement divers biofluides5. Les méthodes courantes comprennent l’ultracentrifugation (UC), la centrifugation par gradient de densité, la chromatographie d’exclusion stérique (SEC), la filtration et l’immuno-isolement6. La CU est une technique largement utilisée, mais elle peut produire des particules de densité similaire qui ne sont pas des VE et peuvent générer des agrégats de VE7. La SEC a gagné en popularité en raison de sa capacité à fournir des échantillons de plus grande pureté en excluant les particules en fonction de leur taille plutôt que de leur densité8. Cependant, une sélection minutieuse de la taille de pores appropriée pour la colonne SEC et l’optimisation des conditions de chromatographie sont essentielles pour minimiser le co-isolement des particules indésirables comme les chylomicrons et les lipoprotéines de basse densité8. Malgré leur efficacité, les deux méthodes sont longues et difficiles à automatiser, en particulier pour les échantillons de plus grand volume comme les milieux cellulaires ou l’urine, ce qui limite leur évolutivité pour les applications industrielles9.
Ces dernières années, le fractionnement asymétrique du champ d’écoulement (A4F) a évolué comme une technique de séparation puissante pour la séparation de particules de taille micro et nanométrique basée sur la taille et la flottabilité10. Le principe de fonctionnement d’A4F repose sur un canal microfluidique doté d’une membrane poreuse à sa base, générant une force exercée vers la membrane appelée tangentiel10. Lorsqu’il est combiné avec le mouvement brownien et l’écoulement de Poiseuille inhérents au système, le flux croisé facilite une séparation efficace des particules en raison de la variation de la position des particules dans la dynamique de l’écoulement11. Malgré les avantages, cette méthode est limitée à des volumes d’échantillons de l’ordre de12 microlitres et nécessite une étape de focalisation supplémentaire, prolongeant la durée du processus10.
Au cours de la dernière décennie, la microfluidique a pris de l’importance en tant qu’outil de séparation rapide, efficace et cliniquement fiabledes VE 13. Cependant, la plupart des méthodes microfluidiques conçues pour la séparation des VE sont optimisées pour les échantillons de VE de petit volume et à forte concentration ou dépendent de procédures de séparation complexes14. De plus, dans le domaine de la microfluidique, le polydiméthylsiloxane (PDMS) est reconnu comme le matériau de référence en raison de sa transparence optique, de sa biocompatibilité et de sa facilité d’utilisation15. Néanmoins, sa propension connue à absorber de petites molécules lipophiles, dont les VE, peut être problématique pour son application dans le domaine desVE13.
Le copolymère d’oléfine cyclique (COC) est un matériau fréquemment utilisé en microfluidique en raison de sa biocompatibilité, de sa faible absorption des molécules et de sa résistance chimique élevée15. Cependant, la fabrication de dispositifs COC implique souvent des processus complexes ou des équipements spécialisés16. Par ailleurs, le thiol-ène hors stœchiométrie (OSTE) est une alternative prometteuse au PDMS en raison de la diminution de l’absorption des petites molécules, de la stabilité chimique supérieure, de la facilité de fabrication et du processus de fabrication évolutif17,18. Cependant, en raison des connexions complexes aux tubes, les appareils peuvent être sujets à des fuites19.
L’objectif de cette étude était de concevoir et de fabriquer un dispositif microfluidique combinant OSTE et COC et le principe A4F bifurqué pour la séparation des VE à partir d’échantillons de grand volume tels que l’urine ou les milieux cellulaires.
Le dispositif microfluidique présenté offre une méthode prometteuse pour l’isolement et l’extraction des VE à partir de fluides biologiques, remédiant à certaines des limites critiques des méthodes de référence existantes telles que UC et SEC12. L’UC et le SEC sont connus pour être à forte intensité de main-d’œuvre, de temps et de faible rendement, ce qui les rend moins adaptés aux applications à haut débit où de grandes quantités de VE sont nécessaires…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions tous les donneurs qui ont participé à cette étude, le personnel de la base de données génomique lettone pour avoir fourni les échantillons. L’Institut de physique des solides de l’Université de Lettonie en tant que centre d’excellence a reçu un financement du programme-cadre Horizon 2020 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 739508, projet CAMART2. Ce travail a été soutenu par le Conseil letton des sciences Projet No. lzp-2019/1-0142 et le projet no : lzp-2022/1-0373.
0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
Resin Tough Black | Zortrax | ||
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
Zortrax Inkspire | Zortrax |