Les souris sont hébergées dans l’animalerie de l’Université du Delaware, maintenue dans un environnement exempt d’agents pathogènes. Toutes les procédures sur les animaux, y compris l’euthanasie par inhalation de CO2 , ont été effectuées conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware. 1. Préparation et imagerie de l’ensemble de la monture d’objectif Fixation d’objectifs pour l’imagerie de l’ensemble de la montureAprès l’euthanasie, énucléer les yeux et disséquer les lentilles comme décrit précédemment25. Après la dissection, transférer immédiatement les lentilles dans une solution saline fraîche tamponnée au phosphate 1x (PBS ; 1,1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na2HPO 4-7H 2O ; pH 7,4) à température ambiante.REMARQUE : La morphologie cellulaire peut être modifiée si les lentilles sont stockées dans le PBS pendant une période prolongée, par conséquent, il est recommandé de les fixer immédiatement dans les ~ 10 minutes suivant la dissection. Pour l’imagerie de la région antérieure du cristallin sur toute la monture, fixez les lentilles entières en les immergeant dans 0,5 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % fraîchement fabriqué dans 1x PBS dans un tube de microcentrifugation à température ambiante. Après 30 min, lavez les lentilles 3x (5 min par lavage) avec 1x PBS. Passez à l’étape 1.2 ou conservez-le dans 1x PBS à 4 °C. Les lentilles fixes peuvent être conservées jusqu’à 5 jours. Pour l’imagerie de la région équatoriale de la lentille à monture entière, fixez les lentilles entières en les immergeant dans 0,5 mL de PFA à 4 % fraîchement fabriqué dans 1x PBS dans un tube de microcentrifugation à température ambiante. Après 1 h, laver les lentilles 3x (5 min par lavage) avec 1x PBS. Passez à l’étape 1.3 ou conservez-le dans 1x PBS à 4 °C. Les lentilles fixes peuvent être conservées jusqu’à 5 jours. Monture entière de la région antérieure du cristallin (fixe ou sous tension)Pour l’imagerie à monture complète d’objectifs fixes, passez à l’étape 1.2.3. Pour l’imagerie à monture complète de lentilles vivantes, transférez les lentilles dans un puits d’une plaque à 48 puits contenant 1 mL de Medium 199 (sans rouge phénolique) contenant 1 % d’antibiotique/antimycosique. Incuber les lentilles à 37 °C et à 5 % de CO2 jusqu’à l’imagerie. Avant l’imagerie, incuber les lentilles dans une solution contenant de l’agglutinine de germe de blé (WGA-640, 1 :500) et du Hoechst 33342 (1 :500) marqués par fluorescence dans un milieu 199 pendant au moins 10 minutes. Passez à l’étape 1.5. Pour colorer la capsule du cristallin, la F-actine et les noyaux des lentilles fixes, placer les lentilles dans une solution de 500 μL contenant du WGA-640 (1 :500), de la rhodamine-phalloïdine (1 :50) et du Hoechst 33342 (1 :500) dans un tampon de perméabilisation/blocage (1x PBS contenant 0,3 % de Triton, 0,3 % d’albumine sérique bovine (fraction V) et 3 % de sérum de chèvre) dans un tube de microcentrifugation. Teindre les lentilles à 4 °C pendant la nuit. Après une nuit d’incubation, lavez les lentilles 3 fois (5 min par lavage) avec 1 ml de PBS 1x. Passez à l’imagerie des lentilles. Pour stabiliser la lentille fixe pour l’imagerie confocale, créer des mottes d’immobilisation de lentille dans l’agarose sur une parabole d’imagerie comme décrit précédemment21 (Figure 1).Chauffer et mélanger doucement l’agarose à 2 % dans le PBS à l’aide d’un micro-ondes jusqu’à ce que la solution soit liquéfiée. Pipeter 250 μL d’agarose liquéfiée à 2 % dans une boîte à fond en verre (figure 1A) et aplatir l’agarose sur la boîte à l’aide d’une lamelle en plastique souple (figure 1B). Une fois l’agarose refroidie et complètement solidifiée, retirez la lamelle à l’aide d’une pince à pointe fine (Figure 1C) et utilisez un poinçon de biopsie de 3 mm pour créer un trou dans l’agarose au centre de la boîte (Figure 1D). Retirez l’excès d’agarose à l’aide d’une lingette délicate (Figure 1E). Garder la moisissure d’agarose hydratée avec 1x PBS et maintenir à 4 °C jusqu’à utilisation. Les moisissures d’agarose ont été stockées avec succès jusqu’à 1 semaine. À l’aide d’une pince à embryons, transférez délicatement la lentille vivante ou fixe dans le divot de l’agarose (Figure 1F), contenant ~2 mL de PBS 1x (lentille fixe) ou de Medium 199 sans rouge phénolique (lentille vivante), puis placez la boîte sur une platine de microscope inversée. Pour confirmer que le cristallin est situé avec la région antérieure face à l’objectif, visualisez la coloration des noyaux. Si aucun noyau n’est observé, la région postérieure peut être orientée vers l’objectif. Pour inverser la lentille, utilisez une pince incurvée et faites pivoter doucement la lentille de ~180° de manière à ce que la région antérieure fasse face à l’objectif. Acquérir des images à l’aide d’un microscope confocal. Pour la visualisation des capsules d’objectif, acquérez des images z-stack à l’aide d’un objectif 40x avec une taille de pas de 0,3 μm. Acquérir la première image avant la surface de la capsule du cristallin (indiquée par la coloration WGA) et la dernière image après la surface apicale des cellules épithéliales. Pour visualiser les cellules épithéliales, acquérez des images z-stack à l’aide d’un objectif 63x avec une taille de pas de 0,3 μm pour la visualisation des cellules épithéliales du cristallin.REMARQUE : Ces paramètres de microscope permettent une reconstruction tridimensionnelle (3D) adéquate des images, ce qui est essentiel pour la quantification de l’épaisseur de la capsule ou de la zone des cellules épithéliales. Il est également possible d’imager des sutures dans des lentilles vivantes tdTomato en imageant au-delà de la monocouche de cellules épithéliales, comme décrit précédemment4. Coloration de l’épithélium équatorial du cristallin et des cellules fibreusesPlacer les lentilles fixes dans une solution de 0,5 mL de rhodamine-phalloïdine (1 :300), WGA-640 (1 :250) et Hoechst 33342 (1 :500) dans une solution de perméabilisation/blocage (3 % de BSA, 3 % de sérum de chèvre et 0,3 % de Triton) dans un tube de microcentrifugation. Maintenir à 4 °C toute la nuit. Après une nuit d’incubation, laver les lentilles 3 fois dans 1 ml 1 PBS (5 min par lavage). Créer des coins d’agarose d’immobilisation de lentille comme décrit précédemment 4,10.En bref, créez des quartiers d’agarose dans des plats à fond de verre (FD35-100, WPI) en versant ~5-6 mL d’agarose fondue à 2 % dans 1x PBS dans des plats (Figure 2A). Une fois que l’agarose s’est solidifiée (figure 2B), créer un divot triangulaire avec une lame tranchante (figure 2C). Retirez le quartier d’agarose et placez 1 mL de PBS 1x dans le plat d’agarose (Figure 2D). Aspirez toute agarose résiduelle qui pourrait être laissée par la coupe de l’agarose. Plusieurs cales peuvent être créées par parabole pour s’adapter à plusieurs tailles différentes de lentilles (non illustrées). Pour conserver le moule à agarose, placez 1mL de 1x PBS sur le moule à agarose et conservez à 4 °C. Les cales peuvent être conservées jusqu’à 1 semaine. À l’aide d’une pince à épiler incurvée, placez la lentille dans un coin d’agarose contenant 1 ml de PBS 1x et ajustez-la de manière à ce que la région équatoriale de la lentille soit orientée vers le bas sur la vitre du microscope au-dessus de l’objectif confocal (Figure 2E-F). Pour confirmer que la région équatoriale est nette, visualisez les noyaux et assurez-vous que les noyaux sont alignés en rangées à l’équateur. Les cellules épithéliales équatoriales peuvent également être identifiées car elles sont irrégulièrement emballées et de forme. De plus, les cellules méridionales sont alignées avec précision et de forme hexagonale, ce qui est indiqué par la coloration de la F-actine au niveau des membranes cellulaires. Si les noyaux dans le champ de vision sont regroupés de manière aléatoire, la face antérieure du cristallin fait face à l’objectif. Si les noyaux ne peuvent pas être observés, la face postérieure du cristallin est très probablement tournée vers l’objectif. Si la lentille n’est pas assise sur son équateur, réorientez-la et utilisez la pince à épiler incurvée pour faire pivoter la lentille jusqu’à ce que les noyaux précisément alignés à l’équateur de la lentille soient observés. Imagez l’épithélium équatorial et les cellules fibreuses du cristallin à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (objectif 20x, NA = 0,8, taille de pas 0,5 μm et/ou objectif d’huile 40x, NA = 1,3, taille de pas 0,4 μm). Faites pivoter les images avant la collecte z-stack, dans laquelle les cellules épithéliales équatoriales se trouvent en haut, suivies des cellules de la rangée méridionale et des fibres juste en dessous. 2. Méthodologie d’analyse d’images Mesure de l’épaisseur de la capsule de lentilleÀ l’aide d’images z-stack obtenues avec un objectif 40x (pas de 0,3 μm) de lentilles tdTomato vivantes marquées WGA ou de lentilles fixes marquées WGA et rho-phalloïdine, obtenez une projection optique 2D dans la vue XZ de la reconstruction 3D et enregistrez-la au format .tif. Traitez les images à l’aide du logiciel Zen. Ouvrez les images de tranche XZ (.tif) dans le logiciel FIJI ImageJ. Pour mesurer l’épaisseur de la capsule de la lentille, utilisez la fonction de ligne droite (illustrée à la Figure 3A,B). Définissez la largeur de ligne sur 50 pixels en sélectionnant Modifier > Options > Largeur de ligne. Cette largeur de raie a été déterminée empiriquement pour fournir un rapport signal/bruit élevé avec les réglages du microscope. La largeur de trait optimale peut différer selon d’autres microscopes/réglages de microscope ou lors de l’utilisation de lentilles d’autres espèces. Ensuite, tracez une ligne de la surface supérieure de la capsule jusqu’en dessous de la région basale des cellules épithéliales. Enregistrez la ligne en tant que région d’intérêt en appuyant sur Ctrl + T. Séparez les couches en onglets pour l’image, la couleur et les couches fractionnées. Mesurez l’intensité le long de la ligne pour le canal de la capsule en appuyant sur Ctrl + K. Dans une feuille de calcul, tracez les valeurs d’intensité en fonction de la distance et déterminez les pics d’intensité de la capsule et de la F-actine, qui représentent respectivement la surface de la capsule et la région basale des cellules épithéliales. Sur l’axe des abscisses se trouve la distance de la ligne. Ensuite, calculez l’épaisseur de la capsule en déterminant la distance entre les pics d’intensité fluorescente de la capsule et de l’épithélium (Figure 3C, D). Analyse de la surface cellulaireÀ l’aide d’images z-stack obtenues à l’aide d’un objectif 63x (NA = 1,4 ; pas de 0,3 μm) sur des lentilles tdTomato vivantes ou des lentilles fixes marquées à la phalloïdine, analysez une tranche de vue XY à partir d’une image confocale z-stack correspondant à l’endroit où la région médiane (latérale) des cellules épithéliales est mise au point. Notez que les membranes latérales sont visibles à l’aide du colorant membranaire tdTomato ou en visualisant la phalloïdine qui est présente au niveau des membranes cellulaires latérales.REMARQUE : En raison de la courbure de l’objectif (comme on le voit dans une vue XZ ; Figure 4A-C), toutes les cellules épithéliales ne seront pas nettes dans l’image. La région médiane de l’épithélium correspond à la région où les membranes latérales cellulaires (Figure 4D-E) et les noyaux (Figure 4G-I) sont focalisés. Exportez l’image au format .tif et ouvrez-la dans FIJI ImageJ. Pour définir l’échelle dans FIJI ImageJ à des fins d’analyse, utilisez l’outil Ligne pour créer une ligne de la longueur d’une barre d’échelle à partir de l’image confocale. Enregistrez la longueur en pixels de la ligne et la longueur de la barre d’échelle. Accédez à Analyser dans le menu de la barre d’outils et sélectionnez Définir l’échelle. Entrez le nombre de pixels, c’est-à-dire la longueur de la ligne, dans Distance en pixels, et entrez la longueur connue de la barre d’échelle. À l’aide de la coloration tdTomato ou rhodamine-phalloïdine comme indication des limites cellulaires, tracez manuellement une population de cellules qui sont nettes dans l’image à l’aide de l’outil polygonal. Ne tracez que les cellules dont les membranes latérales sont visibles (figure 4E) et évitez de tracer des cellules partiellement visibles (c’est-à-dire sur le bord des images). Enregistrez le retour sur investissement en appuyant sur Ctrl+T. Accédez à Modifier dans le menu de la barre d’outils et sélectionnez Effacer l’extérieur. Mesurez maintenant la surface totale de la cellule (ROI) en appuyant sur Ctrl + M dans FIJI ImageJ. Calculez la surface moyenne de la cellule en divisant la zone ROI par le nombre total de cellules. Un moyen simple de déterminer le nombre de cellules est de compter le nombre de noyaux. Allez dans le canal des noyaux (bleu). Dans le menu ROI, sélectionnez le contour des cellules ROI enregistré (Figure 4G). Effacer en dehors du retour sur investissement en accédant à Modifier, puis en cliquant sur Effacer à l’extérieur (Figure 4H). À l’aide de l’outil Multipoint, comptez les noyaux en cliquant sur les noyaux individuels. Analyse de la zone et de la forme du noyau cellulairePour l’analyse de la surface et de la forme des noyaux, analysez une coupe optique vue du plan XY à partir d’une image confocale z-stack correspondant à l’endroit où la région médiane (latérale) des cellules épithéliales tdTomato est mise au point. Analyser une tranche de pile z à partir d’une image confocale où la zone nucléaire est la plus grande (Figure 5A) ; Cela représente la partie médiane des noyaux.REMARQUE : Notez qu’en raison de la courbure de la lentille, tous les noyaux ne seront pas nets, comme on peut le voir dans la vue XZ (Figure 4G et Figure 5A). Sélectionnez une sous-population de noyaux qui sont ciblés et économisez un retour sur investissement. Utilisez la fonction Effacer l’extérieur . À l’intérieur du ROI, à l’aide de l’outil de sélection à main levée (quatrième bouton de menu à partir de la gauche), tracez soigneusement les bords des noyaux (Figure 5B). Enregistrez chaque trace nucléaire dans la fenêtre ROI en appuyant sur Ctrl+T. Ne tracez que les noyaux où les noyaux complets peuvent être vus et où les noyaux ne se touchent pas. Une fois que tous les noyaux sont délimités, mesurez la surface et la forme nucléaires des cellules individuelles (c’est-à-dire la circularité) en appuyant sur Ctrl+M. Copiez et collez les données dans une feuille de calcul et calculez la superficie nucléaire moyenne et la circularité (Figure 5C). Garniture épithéliale méridionalePour mesurer le désordre méridional des rangs, acquérez des images à l’aide d’un objectif 20x (pas de 0,5 μm). Identifiez le point d’appui de l’objectif/modiolus sur les images. Le point d’appui est la région où les extrémités apicales des cellules épithéliales allongées se contractent pour former un point d’ancrage lors de la différenciation initiale des cellules fibreuses et de l’élongation à l’équateur. Identifiez le point d’appui en fonction de l’intensité brillante de la F-actine (indiquée par une pointe de flèche dans la vue XZ de la figure 6A ; indiquée par une ligne pointillée rouge dans la figure 6B) et du changement d’organisation cellulaire dans une seule coupe optique dans la vue XY.NOTE : De plus, la coloration F-actine des régions basale et apicale des cellules épithéliales est apparente au-dessus du point d’appui, alors que seule la région basale des cellules allongées est apparente au-dessous du point d’appui (Figure 6A). Les cellules épithéliales au-dessus de la ligne d’appui sont irrégulièrement tassées et ont tendance à former des rosettes, tandis que les cellules fibreuses situées sous le point d’appui sont disposées en rangées parallèles, ce qui est indiqué par une coloration brillante de la F-actine au niveau de la membrane (Figure 6B). Une fois que le point d’appui est identifié chez les souris âgées de 2 mois, sélectionnez la section optique unique ~4,5-5 μm périphérique au point d’appui (vers la capsule du cristallin) dans le plan XY. Cette distance est choisie sur la base de l’observation que tous les noyaux des cellules méridionales de la rangée chez les souris âgées de 2 mois sont focalisés lorsqu’ils sont périphériques à ~5 μm du point d’appui. Enregistrez la section optique unique (.tif). Ouvrez l’image sur FIJI.REMARQUE : Cette analyse n’a été effectuée que sur des souris âgées de 2 mois et, par conséquent, il n’est pas possible de conclure si cette distance change avec l’âge. Avant d’effectuer l’analyse d’image, définissez l’échelle sur μm dans ImageJ à l’aide de l’étape 2.2.2. Délimitez manuellement l’ensemble des régions de la ligne méridionale à l’aide de l’outil de ligne à main levée (région d’intérêt/ROI) en identifiant l’alignement nucléaire, comme le montre la figure 7A. Enregistrez le retour sur investissement en appuyant sur Ctrl+T. Accédez à Modifier dans le menu de la barre d’outils et sélectionnez Effacer l’extérieur. Mesurez la surface totale de la cellule (ROI) en appuyant sur Ctrl + M dans FIJI ImageJ. Identifiez toutes les régions de désordre indiquées par la coloration de l’actine F en décrivant à l’aide de l’outil de ligne à main levée dans FIJI ImageJ. Les critères pour les régions désordonnées comprennent la ramification des rangs, l’empilement irrégulier et le désalignement des rangs (figure 7B), comme indiqué précédemment20. Mesurez la zone désordonnée délimitée/corrigée en appuyant sur Ctrl + M dans FIJI ImageJ. Additionnez la surface totale désordonnée dans une feuille de calcul. Divisez la surface désordonnée totale par la zone ROI, puis multipliez par 100 pour obtenir un pourcentage de surface désordonnée. Si aucun trouble n’est observé, placez une valeur de 0 % pour la zone désordonnée. Nombre de rangées méridionales des cellules voisinesPour mesurer le nombre de cellules voisines, utilisez des images colorées à la F-actine acquises avec un objectif d’huile 40x (pas de 0,4 μm). Identifiez une coupe optique (plan XY) dans la région basale des cellules de la rangée méridionale vers l’intérieur de la capsule du cristallin où la F-actine est enrichie sur tout le périmètre des cellules de la rangée méridionale, toutes les cellules de la rangée méridienne sont focalisées et sont sur le même plan. Comptez le nombre de cellules adjacentes à chaque cellule de rangée méridionale (Figure 8). Mesurez le pourcentage moyen de cellules avec six cellules adjacentes dans une feuille de calcul.REMARQUE : Déterminez le nombre de cellules adjacentes avec un objectif 20x. Cependant, il est beaucoup plus facile d’observer la forme hexagonale avec un objectif 40x. Analyse d’images de cellules de fibres équatorialesPrenez des images confococaux z-stack de lentilles colorées à la phalloïdine rhodamine avec un objectif 20x (pas de 0,5 μm). Identifiez le point d’appui comme indiqué à l’étape 2.4.2. Une fois le point d’appui identifié, sélectionnez une seule section optique. À des fins de normalisation et de comparaison entre les lentilles, quantifiez les largeurs des cellules de fibres de ~10 μm vers l’intérieur à partir du point d’appui dans le plan XY (Figure 9A). Exportez des images brutes vers FIJI ImageJ. Dans FIJI ImageJ, tracez une ligne (généralement de ~300 à 400 μm de long) à travers plusieurs cellules fibreuses adjacentes pour mesurer la distance entre les pics colorés par l’actine F (analyse par balayage linéaire ; Graphique 9A ; ligne rose). Obtenez l’intensité fluorescente sur la distance de balayage linéaire en FIDJI en appuyant sur Ctrl+K. Ensuite, exportez les données dans la feuille de calcul pour calculer la distance entre les pics (exemple illustré à la figure 9A-B). Cela correspond à la largeur des cellules de fibres.