Automatisation du criblage par cryo-microscopie électronique sur plusieurs grilles à l’aide de Smart Leginon
Summary
Le criblage multi-grilles par cryo-microscopie électronique (cryoEM) est souvent un processus fastidieux qui demande des heures d’attention. Ce protocole montre comment configurer une collection Leginon standard et Smart Leginon Autoscreen pour automatiser ce processus. Ce protocole peut être appliqué à la majorité des grilles de feuilles de trous cryoEM.
Abstract
Les progrès des techniques de cryo-microscopie électronique (cryoEM) au cours de la dernière décennie ont permis aux biologistes structuraux de résoudre régulièrement des complexes de protéines macromoléculaires à une résolution proche de l’atome. Le flux de travail général de l’ensemble du pipeline cryoEM implique l’itération entre la préparation des échantillons, la préparation de la grille cryoEM et le criblage des échantillons/grilles avant de passer à la collecte de données haute résolution. L’itération entre la préparation de l’échantillon/de la grille et le criblage est généralement un goulot d’étranglement majeur pour les chercheurs, car chaque expérience itérative doit optimiser la concentration de l’échantillon, les conditions tampons, le matériau de la grille, la taille du trou de la grille, l’épaisseur de la glace et le comportement des particules de protéines dans la glace, entre autres variables. De plus, une fois ces variables déterminées de manière satisfaisante, les grilles préparées dans des conditions identiques varient considérablement quant à leur capacité à être collectées ou non, de sorte qu’il est recommandé de procéder à des séances de sélection supplémentaires avant de sélectionner les grilles optimales pour la collecte de données à haute résolution. Ce processus de préparation et de criblage des échantillons/grilles consomme souvent plusieurs dizaines de grilles et plusieurs jours de temps d’opérateur au microscope. De plus, le processus de dépistage est limité à la disponibilité de l’opérateur/microscope et à l’accessibilité du microscope. Nous montrons ici comment utiliser Leginon et Smart Leginon Autoscreen pour automatiser la majorité du criblage de la grille cryoEM. Autoscreen combine l’apprentissage automatique, les algorithmes de vision par ordinateur et les algorithmes de manipulation du microscope pour éliminer le besoin d’une intervention manuelle constante de l’opérateur. Autoscreen peut charger et imager de manière autonome des grilles avec une imagerie multi-échelle à l’aide d’un système automatisé de cassettes d’échange d’échantillons, ce qui permet un criblage de grille sans surveillance pour une cassette entière. En conséquence, le temps de l’opérateur pour le criblage de 12 grilles peut être réduit à ~10 min avec Autoscreen contre ~6 h avec les méthodes précédentes qui sont entravées par leur incapacité à tenir compte de la grande variabilité entre les grilles. Ce protocole présente d’abord la configuration et les fonctionnalités de base de Leginon, puis démontre la fonctionnalité Autoscreen étape par étape, de la création d’une session modèle à la fin d’une session de criblage automatisé à 12 grilles.
Introduction
La cryo-microscopie électronique à particule unique (cryoEM) permet de déterminer la structure à résolution quasi atomique des complexes macromoléculaires purifiés. Une expérience de cryoEM à particules uniques ne nécessite qu’une ou deux grilles bien choisies sélectionnées dans un ensemble beaucoup plus large de grilles avec des conditions d’échantillon et de grille variables. Le criblage au microscope pour examiner ces grilles implique l’imagerie de chaque grille à plusieurs grossissements pour déterminer quelle grille répond à la plupart des exigences clés pour la collecte de données à haute résolution, y compris l’épaisseur de la glace, des zones suffisantes pour la collecte complète des données, la pureté des protéines, la concentration des protéines, la stabilité des protéines et les problèmes d’orientation préférés minimaux1. L’optimisation pour ces exigences clés implique souvent un retour d’information entre le criblage au microscope et les conditions de préparation telles que la production de protéines, la sélection du tampon, les détergents potentiels et le typede grille 2,3,4 (Figure 1). Le criblage de grille conventionnel est effectué manuellement ou semi-manuellement avec des logiciels tels que Leginon5, SerialEM6 et EPU7. Le criblage conventionnel oblige l’opérateur du microscope à passer des heures au microscope pour cribler plusieurs grilles, ce qui crée un goulot d’étranglement important dans le flux de travail haute résolution à particules uniques en occupant l’opérateur avec des opérations par cœur plutôt qu’avec l’optimisation de l’échantillon/de la grille.
Auparavant, Smart Leginon Autoscreen et le logiciel d’apprentissage automatique sous-jacent, Ptolemy, ont été introduits, et leurs méthodes et algorithmes sous-jacents ainsi que des exemples ont été décrits 8,9. Plusieurs autres progiciels sont capables de réaliser un criblage multi-grilles entièrement automatisé10, notamment SmartScope11, Smart EPU12 et CryoRL13,14. Pour résoudre le goulot d’étranglement du criblage, Smart Leginon permet à l’utilisateur de configurer d’abord les paramètres de criblage dans une session de microscope modèle, puis d’utiliser les paramètres de cette session de modèle comme modèle pour filtrer la cassette complète de grilles dans le chargeur automatique de microscope. Tout travail manuel pendant le criblage de la cassette est éliminé, ce qui permet à la boucle de rétroaction d’optimisation de se dérouler beaucoup plus efficacement.
Dans ce protocole, le flux de travail complet de Smart Leginon Autoscreen est décrit afin que le lecteur puisse effectuer un criblage cryoEM multi-grilles entièrement automatisé de manière indépendante. Pour ceux qui découvrent Leginon, la première section du protocole décrit l’utilisation conventionnelle de Leginon. Ces connaissances sont composées de plusieurs années d’expérience sur plusieurs microscopes à chargement automatique, qui sont ensuite développées dans la section Smart Leginon suivante du protocole. D’autres vidéos tutorielles peuvent être trouvées sur https://memc.nysbc.org.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons le pipeline de Smart Leginon Autoscreen, ainsi que l’utilisation de base de Leginon pour ceux qui découvrent le logiciel de collecte. La cryoEM à particule unique est en passe de devenir la technique de résolution de la structure protéique tridimensionnelle (3D) la plus productive d’ici la fin de 202417. Le pipeline cryoEM à particules uniques se compose de plusieurs étapes qui sont constamment optimisées pour augmenter la qualité et le débit des données. La figure 2 montre les étapes les plus courantes (préparation des échantillons, préparation de la grille, temps et efforts de criblage, temps de collecte haute résolution, traitement en direct et post-traitement complet) ainsi que d’autres composants du pipeline qui peuvent être améliorés (accès au microscope de criblage, vitesse et précision de la platine, vitesse de la caméra et accès au microscope haute résolution). Les résultats de la plupart des étapes deviennent des boucles de rétroaction dans les étapes précédentes (flèches bleues dans la figure 2), ce qui rend l’ensemble du pipeline hautement interdépendant. Chaque étape de la figure 2 est colorée pour se rapprocher du goulot d’étranglement par rapport aux autres. Smart Leginon Autoscreen réduit considérablement le temps et les efforts de l’opérateur pour le criblage de 12 grilles de 6 h à moins de 10 min, soulageant ainsi ce goulot d’étranglement et permettant un retour plus rapide sur la préparation des échantillons/grilles (Figure 3).
Le protocole comporte plusieurs étapes critiques, illustrées à la figure 1. Il est essentiel que la grille utilisée pour créer la session de modèle soit représentative des grilles restantes à filtrer. Il est important de noter que Leginon se souvient de tous les paramètres de l’ensemble du processus de configuration pour créer une session de modèle (étapes bleues dans la figure 1), ce qui permet de configurer des sessions de modèle récurrentes plus rapidement à chaque fois. Lors de la création d’une session de modèle, l’étape la plus critique consiste à configurer le ciblage à tous les grossissements afin que les paramètres et les seuils reflètent la variation attendue sur les grilles à cribler. Les différents boutons « Test » permettent d’être efficace dans ce processus de configuration. Lors d’une session Autoscreen, il est essentiel de surveiller les premières grilles d’Appion pour détecter rapidement tout problème et le résoudre dans Leginon dès que possible.
Le flux de travail typique du SEMC consiste à alimenter les données Autoscreen dans CryoSPARC Live18 et à utiliser ces informations supplémentaires pour informer les boucles de rétroaction dans la préparation des échantillons/grilles. Pendant les journées intensives d’optimisation cryoEM des chercheurs-opérateurs, les informations sur les conditions de l’échantillon et de la grille sont réinjectées dans la préparation de l’échantillon et de la grille pendant qu’Autoscreen continue de cribler les grilles. Cela permet de geler et de cribler plusieurs dizaines de grilles par semaine8.
Smart Leginon Autoscreen fonctionne pour la majorité (80 % à 90 %) des grilles et des conditions trouées observées au SEMC. Les 10 à 20 % restants des grilles comprennent celles qui ne fonctionnent parfois pas bien – des grilles avec une différence de contraste minimale entre les trous et le substrat ; grilles avec des trous et un espacement plus petits (par exemple, 0,6/0,8) – et des grilles où le ciblage sur plusieurs grilles est souvent peu pratique – Spotiton/Chameleon19,20 grilles qui consistent en des bandes d’échantillon à travers la grille ; Grilles en dentelle. Notez que la collection de grilles inclinées avec Autoscreen est en cours de développement mais n’est pas encore disponible. Il peut être possible de modifier le protocole pour qu’il fonctionne avec des grilles Spotiton/Chameleon en imageant d’abord manuellement les zones de la bande pour déterminer des seuils de paramètres étroits, puis en essayant de regrouper des carrés plus grands et plus petits, respectivement, à l’étape 2.1.7.4, puis en sélectionnant des cibles dans le groupe avec de la glace. L’objectif de cette modification est de faire en sorte que Smart Leginon sépare les cases vides et non vides en deux groupes. Si des paramètres sont trouvés, ils peuvent ne pas bien s’étendre aux grilles restantes à cribler. Il peut également être possible de modifier le protocole pour qu’il fonctionne avec des grilles en dentelle en supprimant le script hl_finding.sh à l’étape 2.1.9.1 et en configurant les paramètres pour cibler les zones plus claires/plus sombres comme vous le souhaitez. Le taux de réussite de cette modification peut varier d’une grille à l’autre en fonction de l’épaisseur de la glace et du matériau de la grille.
Le dépannage pendant une session Autoscreen est possible et parfois approprié. Des modifications des paramètres prédéfinis (par exemple, défocalisation) et de ciblage (par exemple, les seuils de ciblage des trous) peuvent être apportées lors de la collecte automatisée. Pendant la collecte d’une session Autoscreen, une session de grille ne peut pas être annulée car elle se terminera autoscreen.py. Cependant, les boutons Abandonner dans les nœuds de ciblage peuvent être utilisés pour ignorer n’importe quelle partie d’une grille ou une grille entière. Parfois, autoscreen.py peut utiliser trop de mémoire et se figer, offrant deux options : « forcer à quitter » ou « attendre ». Si l’option « forcer l’arrêt » est sélectionnée, l’ensemble du script se termine, ce qui oblige l’utilisateur à réexécuter le script à appliquer aux grilles restantes pour le filtrage. Si ‘attendre’ est sélectionné, le script continuera et les paramètres peuvent être modifiés pour éviter un gel futur, par exemple, en désactivant l’affichage de l’image dans le nœud Exposition, en diminuant la taille des pixels dans l’atlas ou en exécutant un script d’effacement de la mémoire. Si le programme se bloque sans offrir les deux options, les erreurs de mémoire peuvent ne pas se résoudre d’elles-mêmes, ce qui entraîne une interruption de l’acquisition. L’option « forcer à quitter » peut être utile dans ce cas.
Smart Leginon Autoscreen est utilisé régulièrement chez SEMC. Alors que les goulots d’étranglement dans le pipeline cryoEM à particule unique continuent d’être réduits, l’adoption de cryoEM continuera d’augmenter pour aider à répondre aux questions biologiques. Ce protocole est un pas dans la direction de l’optimisation de l’ensemble du pipeline en fournissant une voie claire pour réduire considérablement les boucles de rétroaction.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Une partie de ce travail a été réalisée au Simons Electron Microscopy Center du New York Structural Biology Center, avec le soutien de la Simons Foundation (SF349247), du NIH (U24 GM129539) et de l’Assemblée de l’État de New York.
Materials
| Glacios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | GLACIOSTEM | FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera |
| Krios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | KRIOSG4TEM | XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera |
| Leginon | Simons Electron Microscopy Center | http://leginon.org | |
| Ptolemy | Simons Machine Learning Center | https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy |
References
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. Cryo-EM grid optimization for membrane proteins. iScience. 24 (3), 102139 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Koh, A., et al. Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope. Journal of Visualized Experiments. 181, 63519 (2022).
- Cheng, A., et al. Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon. IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).
- Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
- Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913 (2022).
- Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope. eLife. 11, e80047 (2022).
- Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. Smart EPU: SPA Getting Intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).
- Fan, Q., et al. CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection. arXiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging. bioRxiv. Biophysics. , (2022).
- Lander, G. C., et al. Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- Russo, C. J. The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute’s Hardware Frontiers for CryoET Workshop. CZ Imaging Institute’s Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , (2023).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. 168, 62271 (2021).
- Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).
