שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים והחייאת זני דרוזופילה
Summary
שיטת שימור ארוכת טווח לזני דרוזופילה כחלופה להעברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון טריים רצויה מאוד. פרוטוקול זה מתאר שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים של דרוזופילה והחייאת זנים באמצעות השתלתם בעוברים מארחים אגמטיים.
Abstract
זני דרוזופילה חייבים להישמר על ידי העברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקונים חדשים. זה טומן בחובו סכנה של הידרדרות מוטציות ושינויים פנוטיפיים. לכן פיתוח שיטה חלופית לשימור ארוך טווח ללא שינויים כאלה הוא הכרחי. למרות ניסיונות מוצלחים קודמים, שימור בהקפאה של עוברי דרוזופילה עדיין אינו שימושי מבחינה מעשית בגלל יכולת שחזור נמוכה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לשימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) ולהחייאת זנים באמצעות השתלת PGCs משומרים בהקפאה בעוברים מארחים אגמטיים מסוג Drosophila melanogaster (D. melanogaster). PGCs חדירים מאוד לחומרים מגנים על הקפאה (CPAs), ושונות התפתחותית ומורפולוגית בין זנים היא פחות בעייתית מאשר בשימור בהקפאה של עוברים. בשיטה זו, PGCs נאספים מכ -30 עוברים תורמים, מועמסים לתוך מחט לאחר טיפול CPA, ולאחר מכן נשמרים בהקפאה בחנקן נוזלי. כדי לייצר גמטות שמקורן בתורם, ה-PGCs השמורים בהקפאה במחט מופשרים ולאחר מכן מופקדים בכ-15 עוברים מארחים אגמטיים. בפרוטוקול זה הושגה תדירות של לפחות 15% זבובים פוריים, ומספר הצאצאים לכל זוג פורה היה תמיד די והותר כדי להחיות את הזן המקורי (מספר הצאצאים הממוצע היה 77.2 ± 7.1), מה שמצביע על יכולתם של PGCs שמורים בהקפאה להפוך לתאי גזע של תאי גזע. המספר הממוצע של זבובים פוריים למחט היה 1.1 ±-0.2, ו-9 מתוך 26 מחטים הניבו שני צאצאים פוריים או יותר. נמצא כי 11 מחטים מספיקות כדי לייצר 6 צאצאים או יותר, שבהם נכללים ככל הנראה לפחות נקבה אחת וזכר אחד. הפונדקאי האגמטי מאפשר להחיות את הזן במהירות פשוט על ידי חציית זבובים נקביים וזכרים שזה עתה הופיעו. בנוסף, ל-PGCs יש פוטנציאל לשמש ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום.
Introduction
תחזוקת זני דרוזופילה על ידי העברת זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון חדשים גורמת בהכרח להצטברות מוטציות ושינויים אפיגנטיים לאורך זמן. פיתוח שיטה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה ללא שינויים כאלה הוא הכרחי, במיוחד עבור זני ייחוס שבהם יש לשמור על כל הגנום. מספר ניסיונות מוצלחים לשמר בהקפאה עוברים או שחלות דרוזופילה תוארו 1,2,3. למרבה הצער, הם עדיין לא בשימוש מעשי בגלל יכולת שחזור נמוכה. ואכן, לעוברים בשלב מוקדם יש שיעור הישרדות נמוך לאחר שימור בהקפאה בגלל תכולת החלמון הגבוהה שלהם, המעכבת חדירה ודיפוזיה של חומר מגן קריוגני (CPA) 2,3. חדירות CPA מוגבלת מאוד גם על ידי שכבות השעווה של עוברים בשלב מאוחר. קשה וגוזל זמן למצוא פרק זמן ספציפי שבו לעוברים יש שיעור הישרדות גבוה ושכבת שעווה דקה יותר. לאחרונה, Zhan et al.4 שיפרו שיטות לחדירת עוברים, העמסת CPA וויטריפיקציה והצליחו להקפיא עוברים מזנים מרובים. עם זאת, השיטות אינן קלות ליישום מכיוון שהכדאיות של עוברים לאחר חדירה נוטה להיות גרועה. לכן, שיפור נוסף ופיתוח של גישות חלופיות עדיין נדרשים. שיטות הכוללות שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) הן גישה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה.
השתלת PGC (המכונה גם תאי קוטב) שימשה ליצירת כימרות נבט, במיוחד נקבות, כדי לחקור תהליכים כגון השפעות אימהיות של מוטציות קטלניות זיגוטיות וקביעת מין של תאי נבט 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGCs הם הרבה יותר קטנים מאשר עוברים והם צפויים להיות חדירים מאוד עבור רוב cryoprotectants. יתר על כן, השונות ההתפתחותית והמורפולוגית בין הזנים בעייתית פחות, ופונדקאי אגמטי מאפשר שחזור מהיר של גנומים שלמים. לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה לשימור קריוגניPGC 13, המונעת את השינויים הגנטיים והאפיגנטיים הבלתי נמנעים בזני דרוזופילה. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול המפורט.
שיטת שימור קריוגנית זו דורשת מומחיות ספציפית בטיפול ובמכשור PGC. בעוד שגישה שלב אחר שלב עשויה להיות פתרון יעיל עבור אלה שאינם מכירים אותה, היא עשויה להיות לא מתאימה למעבדות קטנות בשל דרישות המכשור. פרוטוקול PGC זה לשימור קריוגני יכול להיות מותאם בקלות רבה יותר לשימוש עם מיני דרוזופילה שונים ומיני חרקים שונים מאשר פרוטוקולי שימור הקפאה של עוברים בגלל הבדלים התפתחותיים ומורפולוגיים קטנים יותר. PGCs יכולים לשמש גם ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום 14,15,16. לסיכום, ניתן להשתמש בשיטה זו במרכזי מלאי ובמעבדות אחרות כדי לשמור על זני זבובים וזני חרקים אחרים לפרקי זמן ממושכים ללא שינויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גורם קריטי להצלחה בשימור הקפאה והחייאת PGC הוא שימוש בעוברים טובים. יש להשתמש בנקבות צעירות (למשל, בנות 3 עד 5 ימים) לאיסוף עוברים. הן העובר התורם והן העובר המארח מוערכים על ידי בדיקה מיקרוסקופית, ורק אלה בשלב הבלסטודרם (שלב 5) משמשים12. עבור איסוף PGC, אנו בדרך כלל מיישרים כ -40 עוברים תורמים בתקופה של 20 דקות ואוספים PGC מכ -30 עוברים בשלב מוקדם 5; לא נעשה שימוש בעוברים ישנים ופגומים. לאחר שימור בהקפאה והפשרה, PGCs צריכים לשמור על צורתם; PGCs נקרעים בשימור לא מוצלח. עוברים מארחים צריכים להיות גם בשלב 5 ויש להם לחץ פנימי מתון; העוברים צריכים לחזור לאט לאט לצורתם המקורית לאחר דרבון עדין. עוברים מיובשים מדי ולא יבשים מספיק לא יתפתחו באופן נורמלי לאחר ההשתלה. מכיוון שהשתלה הטרוסקסואלית של PGCs אינה מצליחה לייצר גמטות בדרוזופילה 5,10, השתלת PGCs מעוברים מרובים מתורמים לעוברים מארחים היא בעלת סיכוי גבוה יותר להניב מבוגרים פוריים. לשם כך, אנו בדרך כלל אוספים PGCs מכ -30 עוברים לכל מחט.
כהגנה קריואקטיבית, ניסינו אתילן גליקול, דימתיל סולפוקסיד וגליצרול יחד עם סוכרוז בריכוזים שונים. קבענו EBR המכיל 20% אתילן גליקול ו 1 M סוכרוז להיותהטוב ביותר 13; עם זאת, השימוש במגני קריופרוטקציה שונים עשוי לשפר את שימור PGC22.
שיטת שימור הקפאה זו דורשת מיומנויות מיוחדות בטיפול ב-PGC, ויש צורך בכ-6 שבועות של הכשרה כדי לאסוף ולהשתיל PGC בנוחות. כדי להעריך ולשפר מיומנות, ניתן לחלק זאת לשישה שלבי אימון: 1) יישור עוברים על מגלשת זכוכית, 2) שליטה במניפולטור, 3) השתלת PGCs מעובר לעובר אחר ללא הקפאה, 4) השתלת PGCs מ-10 עוברים או יותר ל-5 עד 10 עוברים, 5) השתלת PGCs לאחר החלת CPA, ו-6) השתלת PGCs לאחר הפשרת הקפאה. כל שלב עשוי להימשך שבוע. המטרות קצרות הטווח בשלב 3 הן שיעור בקיעה של 40%, כדאיות עובר לבוגר של 10%-20%, ותדירות של זבובים פוריים של 20%.
שימור קריוגני PGC דורש מכשור יקר וכוח אדם מיומן. לכן, שיטה זו לא יכולה להיות מאומצת על ידי מעבדות רבות. עם זאת, לשיטת PGC הנוכחית יש מספר היבטים חשובים. ראשית, PGCs קטנים בהרבה מעוברים והם חדירים מאוד להקפאה. לעומת זאת, חדירות ההגנה הקפאית מוגבלת מאוד על ידי שכבות השעווה של עוברי דרוזופילה, שהיא הבעיה החמורה ביותר בשימור עוברים בהקפאה. ואכן, מחקרים קודמים עשו מאמצים רבים למצוא חלון זמן שבו לעוברים יש שיעור הישרדות גבוה ושכבת שעווה דקה יותר. השני עוסק בשונות התפתחותית ומורפולוגית בין זנים. PGCs נאספים מעוברים בשלב מוקדם -5 (2 שעות 30 דקות-3 שעות 20 דקות לאחר הטלת ביצית), בעוד ששימור בהקפאה של עוברים מתבצע בשלב 16 עוברים (14-22 שעות לאחר הטלת ביציות). העוברים הם, אם כן, מבוגרים בהרבה ומראים שונות זן גדולה בהרבה בחלון הזמן האופטימלי לשימור בהקפאה בהשוואה לשימור בהקפאה PGC. ואכן, התדירות של פונדקאים המייצרים צאצאים שמקורם בתורם לא השתנתה בין חמישה זנים שנחקרו על ידי Asaoka et al.13, אם כי המארחים לא היו אגמטיים. יתר על כן, ל-PGCs יש פוטנציאל לשמש ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום 14,15,16.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז המניות KYOTO Drosophila על זני הזבובים. אנו מודים גם לגב’ וונדה מיאטה על עריכת כתב היד בשפה האנגלית ולד”ר ג’רמי אלן מאדנז (https://jp.edanz.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) ל- T.T.-S.-K., מענקים (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) מ- AMED ל- S.K., מענק (JP20km0210172) מ- AMED ל- T.T.-S.-K. ו-S.K., מענק סיוע למחקר מדעי (C) (JP19K06780) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) ל-T.T.-S.-K., ומענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (JP18H05552) מ-JSPS ל-S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
References
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Génétique. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
