في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم للفئران

يبدأ الإحساس الجسدي ، وهو الترميز العصبي للمحفزات الميكانيكية والحرارية والكيميائية التي تصطدم بالجلد أو الهياكل الجسدية الأخرى ، بما في ذلك العضلات والعظام والأحشاء ، بالنشاط في الخلايا العصبية الواردة الأولية التي تعصب هذه الهياكل¹. قدمت الأساليب الفيزيولوجية الكهربية القائمة على وحدة واحدة ثروة من المعلومات حول الأنواع الفرعية الواردة المشاركة في هذه العملية وكذلك كيف يمكن أن تتغير خصائص استجابات التحفيز بمرور الوقت^1،2،3. ومع ذلك ، في حين لا تزال هناك أدلة قوية تدعم نظرية الخط المسمى ، والتي تشير إلى أن طرائق حسية محددة يتم نقلها بواسطة مجموعة (مجموعات) فرعية محددة من الخلايا العصبية ، فإن قدرة العديد من المجموعات السكانية الفرعية للخلايا العصبية على الاستجابة لنفس الأنواع من المحفزات الميكانيكية والحرارية والكيميائية تشير إلى أن غالبية المحفزات الحسية الجسدية يتم ترميزها بواسطة مجموعات فرعية متعددة من الخلايا العصبية^{4 ، 5}. وبالتالي ، فإن الفهم الأفضل للإحساس الجسدي لن يأتي إلا مع القدرة على دراسة نشاط 10 ، إن لم يكن المئات ، من الخلايا العصبية في وقت واحد.

سهلت التطورات في الأساليب البصرية مع ظهور تقنيات التصوير البؤري والمتعدد الفوتونات والرقمي ، وبالتالي تقنيات التصوير الرقمي ، القدرة على إجراء تحليلات غير جراحية نسبيا على مستوى السكان للنشاط العصبي ^6,7. كانت إحدى العقبات الأخيرة في تطبيق هذه التكنولوجيا هي تطوير أدوات لتمكين التقييم البصري للنشاط العصبي. بالنظر إلى سرعة جهد الفعل الذي يمكن أن يبدأ وينتهي في أقل من ميلي ثانية ، فإن الصبغة الحساسة للجهد مع القدرة على متابعة التغيرات في جهد الغشاء بسرعة جهد الفعل ستكون الأداة المثالية لهذا الغرض. ولكن في حين كان هناك تقدم هائل في هذا المجال^7،8،9،10 ، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للعديد من هذه الأصباغ لا تزال غير عالية بما يكفي لتمكين تحليل السكان لمئات الخلايا العصبية على مستوى الخلية الواحدة. كنهج بديل ، تحول الباحثون إلى مراقبة التغيرات في تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا ([Ca²⁺] _i). كانت القيود المفروضة على هذه الاستراتيجية واضحة منذ البداية وتشمل حقيقة أن الزيادة في [Ca²⁺] _i هي مقياس غير مباشر للنشاط العصبي¹¹ ؛ أن زيادة في [Ca²⁺]_i قد تحدث بشكل مستقل عن تدفق Ca²⁺ المرتبط بتنشيط قنوات Ca²⁺ ذات الجهد الكهربائي (VGCCs)^12,13؛ أن حجم ومدة عابر Ca²⁺ يمكن التحكم فيهما من خلال عمليات مستقلة عن نشاط VGCC^11،12،14؛ وأن المسار الزمني لعابري Ca²⁺ يتجاوز بكثير مسار جهد^{الفعل 15}. ومع ذلك ، هناك عدد من المزايا المهمة المرتبطة باستخدام Ca²⁺ كمقياس غير مباشر للنشاط العصبي. ليس أقلها نسبة الإشارة إلى الضوضاء المرتبطة بمعظم مؤشرات Ca²⁺ ، مما يعكس حجم التغيير في Ca²⁺ داخل الخلايا وحقيقة أن الإشارة تنشأ من الفضاء ثلاثي الأبعاد للسيتوسول بدلا من الفضاء ثنائي الأبعاد لغشاء الخلية. علاوة على ذلك ، مع تطوير مؤشرات Ca²⁺ المشفرة وراثيا (GECI’s) ، من الممكن الاستفادة من الاستراتيجيات الجينية لدفع التعبير عن مؤشرات Ca²⁺ في مجموعات فرعية محددة من الخلايا ، وتسهيل التحليلات على مستوى السكان في الاستعدادات السليمة (على سبيل المثال ، انظر¹⁶).

بالنظر إلى عدد الأدوات الوراثية المتاحة الآن في الفئران ، فلا ينبغي أن يكون مفاجئا أن GECI قد تم استخدامه على نطاق واسع في هذا النوع. تم تطوير خطوط الماوس مع تعبير GECI التأسيسي في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية الحسية^7،16،17. مع تطور خطوط الماوس التي تعبر عن عمليات إعادة التركيب في أنواع معينة من الخلايا ، من الممكن استخدام استراتيجيات أكثر تعقيدا للتحكم في تعبير GECI¹⁵. ومع ذلك ، في حين أن هذه الأدوات أقوى من أي وقت مضى ، إلا أن هناك عددا من الأسباب التي تجعل الأنواع الأخرى ، مثل الفئران ، أكثر ملاءمة لبعض الأسئلة التجريبية. وتشمل هذه الحجم الأكبر ، مما يسهل عددا من عمليات التلاعب التجريبية التي يصعب ، إن لم يكن مستحيلا ، في الماوس الأصغر ؛ سهولة تدريب الفئران في المهام السلوكية المعقدة نسبيا ؛ وعلى الأقل بعض الأدلة على أن الخصائص الفيزيائية الحيوية وأنماط التعبير للعديد من القنوات الأيونية في الخلايا العصبية الحسية للفئران قد تكون أكثر تشابها مع تلك التي لوحظت في الخلايا العصبية الحسية البشرية من نفس القنوات في الفئران بالنسبة إلى^{الإنسان 18}.

في حين أن نقل المنبهات الحسية الجسدية يحدث بشكل عام في المحطات الطرفية للوارد الأولي ، يجب أن يمر جهد الفعل الذي يبدأ في المحيط عبر الهيكل الذي يضم سوماتا واردة أولية ، يشار إليها باسم الجذر الظهري (DRG) أو العقد ثلاثية التوائم (TG) قبل الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي¹⁹. في حين أن هناك أدلة على أنه ليس كل جهد فعل ينتشر على طول محور وارد أولي سيغزو جسم الخلية²⁰ ، نتيجة لحقيقة أن سوماتا الواردة الأولية متصلة بالمحور العصبي الوارد الرئيسي عبر تقاطع T¹⁹ ، يبدو أن غالبية جهود الفعل التي بدأت في المحيط تغزو سوما²¹. وهذا يمنح ثلاث مزايا تجريبية عند استخدام GECIs لتقييم الترميز السكاني في الواردات الأولية: الحجم الكبير لجسم الخلية بالنسبة إلى المحاور يزيد من الإشارة إلى الضوضاء عند استخدام [Ca²⁺] _i كمقياس غير مباشر للنشاط الوارد. من السهل الوصول إلى DRG بشكل عام ؛ وتقييم النشاط في موقع بعيد مكانيا عن المحطات الواردة يقلل من التأثير المحتمل للجراحة اللازمة لكشف العقد على خصائص استجابة التحفيز للمحطات الواردة. ومع ذلك ، نظرا لأن TG تقع أسفل الدماغ (أو فوق اللوحة) ، فإن الوصول إليها أصعب بكثير من DRG. علاوة على ذلك ، في حين أن هناك العديد من أوجه التشابه بين الخلايا العصبية DRG و TG ، إلا أن هناك قائمة متزايدة من الاختلافات أيضا. وهذا يشمل التنظيم الجسدي تقريبا للخلايا العصبية في TG²² ، والهياكل الفريدة المعصبة ، وأنماط الإنهاء الطرفية المركزية المختلفة^{23،24،25،26} ، والآن قائمة متزايدة من الاختلافات في كل من التعبير الجيني^27،28 وتعبير المستقبلات الوظيفية²⁹. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأننا مهتمون بتحديد الآليات المحيطية للألم ، فإن العدد الكبير نسبيا من متلازمات الألم التي تبدو فريدة من نوعها في النظام الثلاثي التوائم (على سبيل المثال ، الصداع النصفي ، ألم العصب الثلاثي التوائم ، متلازمة الفم الحارق) التي يبدو أنها تنطوي على نشاط شاذ في الحالات الأولية^30،31،32 ، يشير إلى أن TG يحتاج إلى دراسة مباشرة.

وهكذا ، في حين تمت دراسة خصائص استجابة التحفيز للخلايا العصبية TG مع GECIs في الفأر¹⁶ ، لأن الأسباب المذكورة أعلاه تشير إلى أن الفئران قد تكون نوعا أكثر ملاءمة لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية ، كان الغرض من الدراسة الحالية هو تطوير نهج لاستخدام GECIs لدراسة الخلايا العصبية TG في الفئران. لتحقيق ذلك ، استخدمنا نهجا فيروسيا لدفع التعبير عن GECI GCaMP6s في الجهاز العصبي المحيطي. ثم أزلنا الدماغ الأمامي للسماح بالوصول إلى TG. أخيرا ، تم تطبيق المحفزات الميكانيكية والحرارية على الوجه بينما تم تقييم الاستجابات العصبية تحت المجهر الفلوري. تدعم هذه البيانات معا دورا لاستخدام الفئران للتحقيق في التغييرات في TG في العديد من الولايات ، وتوسيع مجموعة الأدوات للمحققين المهتمين بالترميز الحسي في نظام مثلث التوائم.