噬菌体和机器人辅助的近乎连续进化的实用指南

1. 硬件设置 注意：有关PRANCE系统的硬件组件的概述，请参阅 图 2，有关物理组装的这些组件的照片，请参见 图3 。 获取PRANCE系统的主要硬件，包括液体处理仪表、读板器和辅助泵。注：迄今为止，所有PRANCE系统均已在中型到大型液体处理仪器上实施，这些仪器配备了8通道、可单独寻址的移液臂、单活塞96吸头移液臂、用于移动板的机器人夹持器、用于吸头灭菌的集成洗涤站以及能够测量吸光度和发光的集成读板器。 根据液体处理机器人的型号和功能配置加热策略。使用加热板架或加热器介导的机器人气候控制。 建立吸头清洗站，以便吸头重复使用。注意：迄今为止，PRANCE系统一直使用现成的清洗站，尽管原则上，该组件可以很容易地由低成本组件制成。 通过设置在37°C下运行的实时生物反应器作为化学恒温器/涡轮抑制器，建立维持在对数期的细菌培养物来源。或者，在附近的冰箱中，在4°C下，在37°C的对数相（OD600 在0.25和0.45之间）中预先生长的至少1L体积的对数期细菌培养物。确保培养物，无论是冷藏的还是温热的，都使用摇床板或搅拌板定期搅拌，以防止沉淀。 配置首选泵，以便机器人与必要的软件和驱动程序集成。实施软件，使泵能够输送 10-100 mL 量级的液体。注意：请参阅此实施中使用的泵 的材料表 和制造商的网站，了解用于操作这些泵的软件以及如何配置它们的文档。本手稿中所示的PRANCE设置中使用的泵的此类软件在以下GitHub存储库中提供开源，https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE需要至少一个能够泵送三个独立通道的三泵歧管（将细菌输送到细菌储存器，将漂白剂输送到细菌储存器，并将细菌储存器排入废物），每个泵的速度独立校准和控制。过去，人们使用鱼缸泵和水培泵阵列，尽管原则上可以使用任何蟒蛇控制的蠕动泵。基本功能包括使用机器人夹持器将板移入或移出读板器、启动读板器测量以及访问测量值。 3D打印PRANCE系统所需的定制甲板组件，至少包括细菌储存器/分配歧管（“华夫饼”），如 补充文件1 （https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link）所示。将这些容器固定在甲板上，并使用标准的液体处理机器人软件校准其位置。将储液罐连接到泵阵列。注意： 有关如何执行校准的详细信息，请参阅机器人制造商的文档，因为它将依赖于机器人。基于树脂的3D打印机是最合适的; 材料表中给出了所用打印机类型的示例;标准透明树脂与默认打印机设置一起使用。 为系统配备符合当地生物安全建议的排水管。 将实验室器皿放在液体处理机器人的甲板上，如 图 4 所示。 遵循标准安全程序，包括使用标准实验室个人防护设备（即实验室外套、手套和护目镜）。 2. 软件准备 使用 python11 安装用于控制液体处理机器人的开源软件，该软件可从开源 PyHamilton 存储库获得。https://github.com/dgretton/pyhamilton 修改和校准液体处理机器人软件的实验室布局文件，以准确反映机器人平台上的实验室器皿位置，如图 4 所示。注意： 根据提供的文档，此处使用的设置使用液体处理机器人制造商提供的软件。 在 模拟模式下运行PRANCE机器人方法程序。使用以下命令（在 Windows 操作系统中）打开命令行，如 图 5 所示。Windows 键 + R输入：cmd 将父目录更改为机器人方法程序的目录。输入如下命令，路径正确，如 图 5 所示。光盘 c：\Robot_methods_directory\PRANCE 使用 Python 调用带有模拟模式标志的机器人方法程序，如 图 5 所示。py robot_method.py –模拟 选择 Robot Run Control 窗口左上角的 PLAY 按钮，该按钮将在程序执行时打开（图 5）。注意：在继续之前，请确保 PRANCE 方法可以在模拟中无错误地运行。很明显，脚本是否能够在模拟模式下运行而不会出错，因为它将在不调用系统错误处理的情况下完成主程序的多个循环，从而终止主程序循环。 在禁用模拟模式的情况下运行PRANCE机器人方法程序。在相应的目录中打开命令行（图 5）。Windows 键 + R输入：cmd光盘 c：\Robot_methods_directory\PRANCE 使用 Python 调用机器人方法程序，不带标志：py robot_method.py 选择机器人运行控制窗口左上角的“播放”按钮，该按钮将在执行程序时打开。 确认 PyHamilton 可以控制仪器并使其初始化。 建立实时数据同步。注意：迄今为止，PRANCE系统已使用联网计算机，允许用户通过远程文件共享软件或远程桌面监控日志文件和实时板读取器测量图。 关闭自动更新。 3. 运行前准备 确保对数期细菌培养源可用于计划运行所需的所有培养物，并且正在积极搅拌以防止沉淀。使用活性化学恒温器/浊度恒温器或生长停滞的冷藏预生长培养物。 更新控制器清单文件，详细说明每个程序周期将哪种细菌培养物泵入 96 孔泻湖的每个孔中。这样可以精确控制有效的泻湖稀释率。如 图 6 所示。使用DilutionCalculator.xlsx电子表格（作为 补充文件 2 提供）计算泻湖的稀释率，如 图 7 所示。 将robot_method.py文件更新为预期的泻湖高度。要遵循此协议，请使用 14（以毫米为单位）作为程序中变量fixed_lagoon_height的默认值。这相当于系统上 550 μL 的泻湖体积，但可能因所使用的特定 96 深孔板而异。 将干净过滤的移液器吸头放在机器人甲板上的指定位置，并将吸头架粘在吸头支架上，以确保运行过程中的稳定性。 将干净的 96 深孔板放在机器人甲板上的指定位置。 将干净的 96 孔读板放在机器人甲板上的指定位置。 确保读板器托盘未被预先存在的板占用。 确保泵已连接到计算机并分配到正确的地址。 通过激活泵来清洁泵管路，然后泵送漂白剂，然后泵送水。 将泵管路连接到适当的源和输出，密切注意确保正确的管路连接到相关的细菌培养物。 装有漂白剂/水的罐/桶，用于细菌储液罐和移液器吸头清洗。 确保甲板上的所有部件，尤其是移动元件，都稳定在指定位置。 根据当地实施激活加热器以达到目标温度（即 37 °C; 图8）。 运行紫外线杀菌协议文件 10 分钟，以操作制造商提供的液体处理机器人中的内置紫外线杀菌灯（图 9）。选择机器人运行控制窗口左上角的“播放”按钮，该按钮将在执行程序时打开。 使用参数化选项运行文件 600 秒。 确保机器人运行控制软件已关闭。注意：如果运行控制软件的任何现有实例正在运行，机器人方法程序将崩溃。 4、软硬件集成 进行“水运行”，其中PRANCE机器人方法程序在一夜之间运行，用水代替所有培养物和湿试剂。注意： 此测试可以在室温下运行。使用controller_manifest完成如上所述的运行前准备工作，并robot_method设置为1体积/小时的有效泻湖稀释率，如图5和图6所示。 将“细菌进入”管线连接到装水容器，以替换对数相细菌进行水流。注意：可以将食用色素添加到水源中，以跟踪液体在实验过程中的运动。 在相应的目录中打开命令行。 使用 Python 调用机器人方法程序，并使用新的运行标志 （py robot_method.py –new） 并输入请求的参数，包括 日志文件名 （TestRun）、泻湖孔数 （16）、 循环持续时间 （30）、 每个阅读器板测量的循环数 （4） 和 诱导器体积 （诱导器体积为 0 μL 对于该测试运行，在用阿拉伯糖诱导诱变的进化过程中，该值可能为 10 μL），如 图 5 所示。 选择“机器人运行控制”窗口左上角的“播放”按钮，该按钮将在提供参数后执行程序时打开。注意：PRANCE方法可以使用空泻湖板启动，泻湖的液体体积将在前六个循环中平衡到最终体积。 进行“仅细菌运行”，其中PRANCE方案仅在目标温度下进行细菌培养过夜，但不使用噬菌体。使用controller_manifest完成如上所述的运行前准备工作，并robot_method设置为1体积/小时的有效泻湖稀释率，如图5和图6所示。确保加热器在目标温度为 37 °C 时打开。 将“细菌”线连接到所选的对数相细菌源。 在相应的目录中打开命令行。 使用 Python 调用带有新运行标志 （py robot_method.py –new） 的机器人方法程序并输入请求的参数，如前面的第 4.1.4 节所述。 选择“机器人运行控制”窗口左上角的“播放”按钮，一旦提供了参数，该窗口将在程序执行时打开。 进行“感染测试”，其中携带进化蛋白质的噬菌体受到挑战，以在需要该蛋白质的细菌上繁殖。注意：提前决定哪些泻湖将接种噬菌体，哪些泻湖将不接种，从而作为无噬菌体控制泻湖以检测交叉污染。如图5和图6所示，使用controller_manifest完成如上所述的运行前准备工作，并robot_method设置为1体积/小时的有效稀释率。确保加热器在目标温度为 37 °C 时打开。 将“细菌”线连接到所选的对数相细菌源。 在相应的目录中打开命令行。 使用 Python 调用带有新运行标志 （py robot_method.py –new） 的机器人方法程序，并输入请求的参数，如前面第 4.1.4 节中所述。 选择“机器人运行控制”窗口左上角的“播放”按钮，该按钮将在提供参数后执行程序时打开。 在添加噬菌体之前，运行该方法2-3小时以平衡泻湖板中的体积和细菌OD。 当程序处于睡眠状态时，在运行周期结束时用 106 pfu/mL 噬菌体接种噬菌体泻湖（例如，通过斑块测定或 qPCR 测定的 108 pfu/mL 的 5.5 μL噬菌体等分试样）接种到 550 μL 泻湖中。 运行程序过夜，然后通过斑块测定或qPCR检查泻湖孔中的噬菌体滴度。