使用 Harwell 的结晶设施和 Beamline VMXi（金刚石光源）进行结晶和 原位 室温数据收集

1. 使用哈韦尔的结晶设施在 原位 板内生产晶体 注意：许多不同的途径都支持对 CF 的访问，具体取决于项目的应用和用户类型（学术或行业）。XChem 和 MPL 项目通过用户管理系统 （UAS） 拥有自己的提案申请系统，可以通过标准访问途径（包括 iNEXT Discovery 和 EUbOPEN）或 BAG Access 提交。以下协议特定于 VMXi 用户。 提案提交和访问准备向 BAG 提案申请提供有关项目的信息，或将其添加到活动的 BAG 提案中。通常有一个 BAG 协调员，负责组织文书工作。或者，提交快速访问建议以访问光束线。 确保样品在通过快递或亲自到达现场之前已在 UAS 中注册并进行了安全验证。 确保用户已注册（使用 FedID 和密码）。 确保 BAG 协调员已将用户作为 UAS 中的关联添加到 MX 提案中。 填写光束线结晶样品详细信息表，并将表格发送给 VMXi@diamond.ac.uk。 与光束线工作人员就实验要求和光束线可用性进行沟通。 如果运送蛋白质样品，请仅通过事先安排发送样品。有关详细信息，请参阅第 1.2 节。 如果用户要到现场在 CF 中设置结晶板，请与设施工作人员联系是否有时间段来使用设施仪器，并遵循第 1.2.1 节。 如果用户将板带到现场，请确保将样品分配到正确的板类型中，并将结晶液滴放置在正确的位置和正确的数量。按照第 1.2.2 节操作。光束线仅 接受特定的原 位结晶板（Greiner CrystalQuickX 和 MiTeGen In Situ-1）;确保滴剂不大于 200 nL。 在CF中进行的结晶实验注：该设施提供了多种高通量大分子结晶方法，例如蒸汽扩散以及油和LCP下的批量结晶。建议从70-100μL纯蛋白质开始，使用100nL蛋白质溶液和100nL结晶储液的比例进行三次筛选，并在20°C下孵育板，对可溶性蛋白质进行蒸汽扩散实验。 该设施内有许多商业屏幕。湿度和温度控制可用，最常用的是 4 °C 和 20 °C。访问CF的用户将接受标准化培训，并支持操作结晶仪器，并将使用本文所述的设置。运送样品以在 CF 设置注意：在到达现场之前，蛋白质样品必须已根据 UAS 系统内的提案进行验证。一旦蛋白质样品到达现场，工作人员将按照之前与用户沟通中的指示进行结晶实验。确认将通过电子邮件发送，其中包含实验结晶板的条形码信息。用户将被要求将结晶板作为容器添加到相关提案中。完成此操作后，板可以存储在结晶设施或光束线的自动成像仪中。ISPyB 将是用于光束线交互的接口。提供浓度为 25 μL 等分试样的倍数结晶的蛋白质样品溶液。清楚地标记含有蛋白质样品的样品管。 如果需要，提供蛋白质缓冲溶液、配体溶液或储液库溶液。 告知设施工作人员应使用哪些筛网和掉落率。 结晶板设置注意：我们要求 Greiner CrystalQuickX 和 MiTeGen 原位 1 板中的结晶液滴位于特定位置;在其他地方设置的盘子应使用此处描述的以下 Mosquito13 设置。要调整 MiTeGen In Situ-1 的孔板定义，请打开 Mosquito SPT 软件，然后单击标准 MiTeGen In Situ-1 孔板定义页面，单击设置 | 96孔 |MiTeGen原位-1（96×2滴）（图2A）。单击编辑按钮并修改子孔 2 位置的值：X 偏移量为 – 1.2，Y 偏移量为 1.8，子孔 3 位置的值：X 偏移量为 1.3，Y 偏移量为 1.8（图 2B，C）。 要调整 Greiner CrystalQuickX 的孔板定义，请打开 Mosquito SPT 软件，然后单击设置 | 96孔 |Greiner CrystalQuickX（图2D）。单击编辑按钮并修改子孔 1 位置的值：X 偏移量为 – 1.95，Y 偏移量为 1.45，子孔 2 位置的值：X 偏移量为 1.95，Y 偏移量为 1.45（图 2E，F）。 2. 使用金刚石光源的光束线 注意： 用户与光束线的所有交互均使用 ISPyB11 接口远程进行。不需要在光束线上实际存在，并且使用基于队列的系统收集数据，而不是在特定时间安排数据。用户将获得与其钻石光源访问权限关联的提案。在光束线上，每个结晶板都被分配了一个唯一的访问，并被定义为ISPyB11 中的一个“容器”，类似于一个包含100 K样品的冰球。 优化屏幕不能使用SynchWeb界面创建，因此，信息通常被添加到注释部分（参见步骤2.1.4）。注册车牌的个人需要检查电子邮件地址，因为车牌所有者将收到有关成像的电子邮件以及车牌完成的通知。 套准车牌使用适当的 Diamond FedID 登录 ISPyB，然后选择提案。通过在搜索栏中滚动或键入提案编号来搜索感兴趣的提案。从建议编号（图 3A）下的下拉菜单中选择“装运”，这将打开“装运”窗口，其中包含该建议中的货件。单击右上角的“+添加货件”（图 3B）以打开“添加新货件”窗口，为货件指定名称，单击“自动/成像器”，然后单击左下角的“添加货件”按钮（图 3C）。 在装运窗口（图3D）中，单击 “+添加集装箱”，然后将显示 “添加集装箱 ”页面视图（图3E）。在 容器类型 下拉菜单中选择任何一种相关的板类型。页面将更改以反映所选的容器类型。根据特定于实验板的光束线工作人员的电子邮件说明输入 条形码 和 容器名称 。请注意，它区分大小写。 从“请求的成像器”下拉菜单中选择VMXi 20°C成像仪，从“成像计划”下拉菜单中选择斐波那契成像计划，从“结晶屏幕”下拉菜单中选择结晶屏幕，从“所有者”下拉菜单中选择用户名，单击“查看”按钮，然后在“电子邮件”框中输入正确的联系人电子邮件地址（图3F）。 在 “注释 ”框中输入有关该板的更多详细信息。从 蛋白质 下拉菜单中选择相关样品，并在实验提案中使用在 UAS 中注册并经 Diamond 批准的首字母缩略词。在“ 样品名称” 框中输入相同的名称;将剩余的框留空。 单击 +Plate 图标以在整个板上复制样品，并用绿色方块填充整个容器。单击页面底部的 +Add Container 以注册板。要求光束线的工作人员将板转移到适当的成像仪，在那里它将被存储和成像。当容器存储在成像仪中时，将生成访问，用户将收到一封电子邮件，其中包含指向板及其图像的链接。 查看成像结果导航到感兴趣的提案（步骤 2.1.1），从提案编号下方的下拉菜单中选择容器，然后观察提案的可用容器列表。如果存在其他样品架类型，请选择过滤板。若要进一步缩小搜索范围，请选中“我的容器”框，以仅显示与当前登录用户 ID 关联的最相关的容器。 通过将光标移到单个行上并单击鼠标左键来单击相应的容器。 选择容器后，将显示一个新视图，显示板的概览（图4A）。单击显示屏左侧板表示中的一个水滴，以显示相应水滴的最新图像。使用箭头键在掉落点之间导航，或使用鼠标/光标选择单个掉落点。 要查看液滴的历史图像，请单击 H 按钮并等待弹出的图像库出现在当前油滴图像上。将光标悬停在各个图像上以更新主投影图像。 按 0 – 9 按钮对图像进行评分以指示每次跌落的状态。要查看各个类别，请打开下拉图像左上角的 “得分 ”。在每个墨滴图像中寻找蓝色十字，这是经过训练以在图像中寻找“晶体”的算法 （CHiMP） 的结果。 单击投影右上角名为 “测量” 的第三个图标按钮以访问测量工具。要使用此工具，请单击并拖动 一条线，标尺将延伸并给出以 μm 为单位的距离。 要请求其他成像会话，请从页面底部的“操作”（Actions） 旁边的下拉框中单击“可见”（Visible） 或“UV”（UV）。然后，单击“请求板成像”按钮。 晶体选择/CHiMP要手动添加用于数据收集的点，请按 +标记点 按钮。将光标悬停在所需的兴趣点上并选择。等待红叉出现。注意：每次放置最多可以创建 100 个对象。 标记完所有点后，单击 “+完成 ”按钮。请记住，在尝试测量对象之前，还要单击 “+完成 ”按钮。要添加区域以通过网格扫描进行数据收集，请单击 +标记区域 按钮。单击 左上角的点 并向下和向右拖动以创建一个将在光束线上进行栅格扫描的区域。与点一样，在创建所有所需区域后单击 +Finish 按钮。注意：最好创建一个更大的区域，而不是创建许多小区域。 观察墨滴图像上已有的蓝色十字，这是旨在自动定位晶体物体 （CHiMP） 的算法的结果。要可视化结晶液滴的 CHiMP 评估，请单击“ 显示自动分数 ”复选框，然后更改 “类”的下拉菜单。通常，这里最有用的设置是 晶体 选项（图4B）。注意：这是一项新功能，不能保证找到所有晶体，也可能找到其他不是晶体的物体。 在相应的放置中标记了所有点和区域后，单击页面底部的 准备数据收集 按钮。 准备用于数据收集的样本观察包含上一步选择的点或区域或自动定位的样品列表（图4C）。按 + 按钮添加单个点或区域，或通过单击 “将当前页面添加到队列” 按钮添加所有显示的样本。 过滤器可用于仅显示 点、区域、自动点 或 手动 点。要仅显示那些尚未拍摄（即暴露于 X 射线）的样品，请单击滤镜按钮上方的“ 无数据 ”和 “未完成 ”选项。 通过单击相应的行选择单个样品，并更新屏幕右侧的图像以显示正确的液滴和单个点。如果列表中有许多样本，则通过选择下拉菜单来增加每页显示 的样本数 ，默认为 10 个，最多 100 个作为显示的最大样本数。 将所有点和区域添加到队列后，确保所有实验数据收集参数都与每个实验相关联。使用 “点”、“区域”、“手动”和 “自动”的过滤器。单击 “点 ”过滤器，然后单击过滤器按钮下方的“ 全选 ”复选框，以同时将参数应用于当前 “排队样品 ”列表中可见的所有样品。 从屏幕右侧的下拉菜单中选择实验参数，在投影照片下方（图4D）。对于 区域，请选择 网格扫描数字万用表 10 微米步长，100% 传输选项。对于所有其他 点 实验，请根据需要从下拉菜单中选择其他选项。 对于振荡数据收集，请单击 Omega Scan DMM 60 度 5% 透射 率选项，以从单个样本中收集最大数量的数据。对非常小的晶体或对辐射敏感的样品应用小旋转，并根据特定晶体形式的先前经验改变透射率。正确应用所有样品的实验参数后，单击页面底部的“ 队列容器 ”按钮。 一旦板到达队列的顶部，它将被呈现给光束线，收集数据集，然后它将再次返回光束线内的样品存储。从板中收集数据后，查找带有链接的电子邮件以访问相关数据。 创建示例组注意：可以创建样品组以对多个液滴或板中的相似样品进行分组。一旦被 DIALS 处理，这些样本组中的所有数据集都将使用 xia2.multiplex14 管道进行处理。这在收集许多非常小的数据楔形时很有用，也可能有助于增加配体结合实验的信噪比。从建议编号下的下拉菜单中选择“示例组管理”。查找组列表（如果组已由其他用户创建）。要生成新组，请单击“+创建样品组”按钮。从“创建样品组”页面的下拉菜单中单击装运以查看样品查看器（图5A）。单击包含填充列表中相关示例的容器。 单击容器后，查找显示板概览的图形。 通过单击单个放置来单独单击放置（图5B），或通过单击相关的行字母或列号单击行或列中的放置。选择与单个组关联的所有孔后，在 “样品组名称 ”框中输入该组的名称，然后单击 “保存样品组 ”按钮。单击此页面上的 “查看样品组” 按钮，返回到与提案关联的已生成样品组的列表（图 5C）。 编辑示例组单击 “示例组管理”（Sample Group Management ） 页面上组列表中的示例组。 单击组信息下方显示的容器旁边的 +Edit Sample Group 按钮（图 5C）。 观察已与样品组关联的液滴，在板概览上突出显示。 像以前一样，通过单击液滴、孔或色谱柱，向样品组添加更多液滴。注意：不能从样品组中去除液滴。 添加其他液滴后，编辑“ 样品组名称 ”，然后保存它，或者只需单击“ 保存样品组 ”按钮即可保存。 可视化和分析样本组的输出单击样品组列表中的单个组，以显示与该组关联的一个或多个容器的板概览。该组中包含的液滴将在此显示屏上突出显示（图5D）。 如果在此组中收集了数据，请查找包含按时间顺序排列的最后三个多路复用作业的列表。 单击多路复用运行的行以更新下面的处理结果。 观察 快速链接 按钮，该按钮显示与组关联的数据集数。单击此按钮可打开一个新的 “数据集合” 页面，其中显示各个数据集集合。 3. 访问自动数据处理 注意：收集数据后，它们将通过多个自动数据处理管道传递。Diamond MX 光束线上使用的四条标准管道也基于光束线收集的数据运行。它们是“fast_dp”、“xia2 dials”、“xia2 3dii”和“autoPROC”15。“fast_dp”将提供快速的数据缩减，以快速评估质量。其他三个管道将需要更多的计算时间，并运行各种不同的数据缩减软件包进行比较。因此，输出的质量通常高于“fast_dp”输出。在光束线上收集的数据集还将通过自动多晶合并软件“xia2.multiplex”14运行，该软件将合并定义组内的所有数据集。请注意，虽然网格扫描当前不会自动处理，但可以使用“xia2.ssx”管道手动处理数据。可以使用以下协议在 ISPyB11 中找到自动处理管道的结果。 查找数据集如上所述登录 ISPyB，然后选择 “提案”。 通过在搜索栏中滚动或输入提案编号来搜索 感兴趣的提案 。 从屏幕上显示的列表中单击 所需的访问 ，以访问该访问的 “数据收集 ”窗口。 应用任何所需的过滤器。注意：一种流行的筛选器是“自动集成”筛选器，它仅显示已通过一个或多个处理管道成功运行的数据集。这将排除网格扫描，因为这些扫描目前不是通过 ISPyB 自动处理的。 向下滚动页面以查找感兴趣的数据集。注：每个数据集将显示样品ID、使用的实验参数、衍射图像查看器、晶体图像查看器和每图像分析图，以便快速观察数据质量。 访问自动处理结果单击特定实验数据摘要下方的 “自动处理 ”选项卡，以检查自动数据缩减的结果（图6A）。 单击与不同管道对应的不同选项卡，查看每个输出的详细摘要。注意：如果已定义样品组，则将有两个选项卡对应于多路复用作业。一个将对应于该点之前组中所有数据集的合并，而另一个将对应于仅该放置内数据集的合并。 单击“日志和文件”按钮以下载生成的 .mtz 文件（如果处理成功）以及任何关联的日志文件。单击“自动处理”部分下方的“下游处理”选项卡，查看 DIMPLE 的输出。注意：仅当在示例提交期间提供了 PDB 文件时，DIMPLE 才会运行。 单击 “日志和文件 ”按钮，从DIMPLE下载任何结果输出。 要访问组多重结果，请打开屏幕顶部的下拉菜单，上面写有提案编号，然后单击样品组管理。单击与正确容器中所需组相对应的行。向下滚动以找到与该组对应的多路复用输出列表，如板图所示。从给定的列表中单击 所需的多路复用输出 。单击 xxx 数据集 按钮，其中 xxx 是合并数据集的数量（图 6B）。注意：这将打开 “数据收集 ”屏幕，但仅显示所选多路复用作业中的数据集。 单击顶部实验的“ 自动处理 ”选项卡。 单击与正确数量的合并数据集相对应的 “多路复用处理 ”选项卡。 单击 “日志和文件 ”按钮以下载 .mtz 和相应的日志文件（如步骤 3.2.3 所示）。 访问网格扫描结果导航到所需访问的 “数据收集 ”屏幕。网格扫描数据结果将与收集的任何旋转数据一起显示。注意：不会有自动处理结果。 晶滴的图像将使网格与表示衍射存在的热图重叠。单击 正方形 可查看网格中该位置的衍射图像。单击 晶体井图像顶部的 下拉菜单以更改热图所表示的内容。默认值为总衍射 强度 ，但可以更改为 总光斑、估计分辨率或 无冰帧。 4. 数据再处理 注意：可以通过 ISPyB11 接口使用相同的处理管道对选定的数据集进行重新处理，这些管道使用用户定义的更改设置自动运行。可以应用分辨率截止;如果晶体的对称性/单元是已知的，那么也可以定义这一点，以确保处理管道在正确的设置下运行。还可以使用可用的多晶管道合并特定数据集中的选定图像范围。如果系统辐射损伤导致衍射图像的后半部分质量较差，这可能被证明是有利的。用户还可以选择使用上述协议下载他们的数据集并在本地运行他们想要的再处理软件，其教程可在其他地方免费获得 （https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ）。 重新处理多个单独的数据集登录 ISPyB 并导航到感兴趣的数据集（步骤 3.1）。 单击数据集并单击数据集标题栏中的齿轮图标（图 6）以打开重新处理窗口。 配置任何所需的设置，并选择将包含在重新处理中的帧。注：可以通过在标记框中键入范围或通过单击并拖动每图像分析图中的所需区域来定义图像范围（图7A）。 可选：要添加另一个数据集以进行单个再处理，请单击其 齿轮 图标，它将显示在第一个数据集下方的再处理窗口中。勾选 单独处理 框。 单击 “集成” 按钮。 重新处理多晶数据从任何数据集打开重新处理窗口。 单击 “多晶” 按钮以打开一个新屏幕。 向下滚动以查找访问期间实验中的一系列每图像分析图。 从下拉菜单中选择 处理管道 。 可选：定义任何 分辨率限制 或 已知的晶胞参数。 单击并拖动以定义要包含在多晶再处理中的图像范围（图 7）。注意：这应该在多个不同的图上完成，以便合并来自多个不同晶体的数据集。 单击 “集成 ”按钮（图7B）。 访问重新处理的数据导航到特定访问的 “数据收集 ”页面（步骤 3.1.1-3.1.3）。 单击屏幕顶部的 “重新处理 ”按钮。 向下滚动以找到 所需的作业。 单击右列中的 文件路径 ，打开重新处理的数据的 “数据收集 ”屏幕。 打开 “自动处理 ”选项卡并按前面所述下载数据（步骤 3.2）。注意：任何重新处理的作业都可以通过管道名称旁边的 圆形箭头 符号来识别。