Eine vielseitige Verhaltensmethode zur Untersuchung der Auswirkungen von Schilddrüsenhormonen auf die Kleinhirnfunktion
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für einen kürzlich entwickelten vielseitigen Verhaltenstest vor, den Leiterbalkentest. Dieser Test hat den Vorteil, dass er eine subtile zerebelläre Ataxie erkennt, die durch einen Defekt der Schilddrüsenhormonwirkung im Zentralnervensystem verursacht wird, gegenüber den herkömmlichen Verhaltenstests zur Beurteilung der motorischen Leistung.
Abstract
Die Wirkung des Schilddrüsenhormons (TH) ist während der Entwicklung des Zentralnervensystems, einschließlich des Kleinhirns, unerlässlich. Im Falle eines TH-Mangels im frühen Leben, wie z. B. einer angeborenen Hypothyreose, zeigen die Patienten neurologische Störungen wie kognitive Retardierung und motorische Defizite. Es gibt verschiedene Studien an Mausmodellen mit gewebe- oder zellspezifischem TH-Mangel, um die Rolle von TH im Kleinhirn zu untersuchen. Im Vergleich zu generalisierten angeborenen Hypothyreose-Mäusen zeigen Kleinhirnzell-spezifische TH-defiziente Mäuse mildere und subtilere ataktische Merkmale, was die Beurteilung der motorischen Funktion bei herkömmlichen Tests wie dem Rotarod-Test erschwert.
Aufgrund des Bedarfs an einem alternativen Werkzeug zur Beurteilung der motorischen Funktion in TH-bezogenen Tiermodellen haben wir eine vielseitige Verhaltensmethode namens “Ladder Beam Test” entwickelt, bei der wir die verschiedenen Leitertests je nach Schweregrad der Ataxie bei Modellmäusen gestalten können. Wir verwendeten transgene Mäuse, die einen dominant-negativen TH-Rezeptor spezifisch in der Kleinhirn-Purkinje-Zelle exprimierten, ein einziges Ausgangsneuron in der Kleinhirnrinde, das die motorische Leistung moduliert. Der neu entwickelte Leiterstrahltest konnte bei den transgenen Mäusen im Vergleich zum Rotarod-Test auf einem höheren Niveau robuste Beeinträchtigungen der motorischen Leistung nachweisen. Eine Störung des motorischen Lernens wurde auch im Leiterbalkentest festgestellt, nicht jedoch im Rotarod-Test. Das Protokoll mit diesem neuartigen Verhaltensapparat kann auf andere Tiermodelle angewendet werden, die einen milden ataktischen Phänotyp aufweisen könnten, um subtile Veränderungen der Kleinhirnfunktion zu untersuchen.
Introduction
Das Schilddrüsenhormon (TH) ist für die Entwicklung des Gehirns unverzichtbar1. Insbesondere seine Rolle im Kleinhirn ist entscheidend, da TH-Mangel im frühen Leben zu einer aberranten Kleinhirnentwicklung führt 1,2. Zum Beispiel zeigen Patienten bei angeborener Hypothyreose eine Reihe von neurologischen Behinderungen, einschließlich kognitiver und motorischer Defizite3. Um die Rolle von TH bei der funktionellen Entwicklung des Kleinhirns aufzudecken, haben einige Studien den TH-Mangel auf kleinhirnzellspezifische Weise begrenzt4. Im Vergleich zu generalisierten angeborenen Hypothyreose-Mäusen, bei denen alle Gewebe und Zellen von TH-Mangel betroffen sind, weisen solche Kleinhirn-spezifischen Modelle jedoch eine so subtile Ataxie auf, dass die konventionellen Verhaltenstests wie Rotarod-, Footprint- und Schwebebalkentests die Unterschiede kaum erkennen. Um die TH-Effekte auf die Kleinhirnfunktion vollständig untersuchen zu können, wird daher ein neues Bewertungsinstrument benötigt, um eine subtile Veränderung in der motorischen Koordination von Modellmäusen zu erkennen.
Der Rotarod-Test ist das gebräuchlichste Instrument zur Beurteilung der motorischen Koordination, das ursprünglich von Dunham und Miya5 entwickelt und später von Jones und Roberts6 auf eine beschleunigende Version angewendet wurde. Die Latenz, um von der rotierenden Stange zu fallen, wird als Test für die motorische Koordination interpretiert, und ihre Einfachheit und Prägnanz machen sie unter Verhaltensforschern, die die motorische Funktion untersuchen, häufig verwendet7. Die einfache Handhabung dieses Tests ist jedoch ein zweischneidiges Schwert. Da sich der Stab automatisch dreht, können sich Mäuse an dem rotierenden Stab festhalten und dort bleiben, ohne sich zu bewegen. Darüber hinaus können Mäuse beabsichtigen, herunterzufallen, anstatt weiter auf der rotierenden Stange zu balancieren. In beiden Fällen sind die Validität und Zuverlässigkeit des Tests für die Beurteilung der “reinen motorischen Koordination” fragwürdig7. Mit anderen Worten, es zielt nicht genau auf die Kleinhirnfunktion ab und bezieht andere Faktoren wie die Muskelkraft beim Greifen mit ein.
Anstelle der herkömmlichen Werkzeuge zur Beurteilung der motorischen Koordination präsentieren wir hier einen neuartigen Verhaltenstest namens “Leiterbalkentest”, der kürzlich in unserem Labor entwickelt wurde. Der horizontale Leiterlauftest wurde entwickelt, um die komplexen motorischen Fähigkeiten des Kleinhirns zu bewerten: Feed-Forward-Vorhersage und Integration von Bewegung8. Das Testgerät bestand aus vier Plexiglasstücken mit Löchern (Abbildung 1). Die vier Platten wurden durch Schrauben und Stäbe, die in die Löcher der Platten gesteckt wurden, parallel verbunden. Zwei äußere Platten wurden verwendet, um das Gerät zu stabilisieren, und zwei innere Platten wurden verwendet, um die verschiedenen Arten von Leitersprossen zu entwerfen (Abbildung 2C). Die Breite der Sprosse wurde je nach Tiergröße angepasst, um das Rückwärtsbewegen der Tiere zu minimieren (Abbildung 2B). Der Abstand vom Startpunkt bis zum Ziel betrug 110 cm. Das Gerät befand sich 60 cm über der Bank und ein Sicherheitskissen wurde unter das Gerät gelegt (Abbildung 2A). Die dunkle Kammer wurde in der Nähe des Ziels platziert, um die Tiere zu motivieren, sich auf das Ziel zuzubewegen (Abbildung 2A).
Wir untersuchten die TH-Effekte auf die funktionelle Entwicklung des Kleinhirns anhand von transgenen Mäusen, die den dominant-negativen TH-Rezeptor (TR) in kleinhirnförmigen Purkinje-Zellen (Mf-1/FVB-Mäusen) exprimierten. Sowohl in Rotarod- als auch in Ladder-Beam-Tests beobachteten wir einen zerebellären ataktischen Phänotyp bei Mf-1/FVB-Mäusen; Der Leiterbalkentest konnte jedoch signifikantere Unterschiede feststellen als der Rotarod-Test (Abbildung 3). Darüber hinaus kann die motorische Lernfähigkeit im Leiterbalkentest gründlicher beurteilt werden (Abbildung 3B,C). Als zellulärer Hintergrund eines solchen Verhaltensphänotyps wurde die Induktion der Langzeitdepression (LTD) gehemmt und stattdessen die Langzeitpotenzierung (LTP) nach einer LTD-induktiven Stimulation in Mf-1/FVB-Purkinje-Zellen induziert9. LTD ist essentiell für die motorische Koordination und das motorische Lernen im Kleinhirn10. Viele Studien haben über motorische Defizite und die Hemmung von LTD bei Knockout- oder mutierten Mäusen für Schlüsselregulatorgene in der Kleinhirnfunktion berichtet, jedoch haben keine Studien jemals über die Induktion von LTP nach einer LTD-induktiven Stimulation berichtet11,12. Zusammengenommen könnte dieses Phänomen nur bei Mf-1/FVB-Mäusen oder TH-defizienten Mäusen auftreten (das gleiche Phänomen wurde bei adulten Hypothyreose-Mäusen beobachtet), was darauf hindeutet, dass TH die Kleinhirnfunktion anders reguliert als die anderen Schlüsselproteine. Wenn ja, ist es plausibel, dass Mäuse mit abnormaler TH-Wirkung keine zerebelläre Ataxie in der gleichen Weise aufweisen wie andere Modellmäuse. Dies unterstreicht erneut die Notwendigkeit einer spezifischen Methode zur Beurteilung der TH-Effekte auf die Kleinhirnfunktion. In dieser Arbeit wird ein neuartiges Protokoll zur Untersuchung von TH-Effekten auf die Kleinhirnfunktion mit Hilfe des neu entwickelten Leiterstrahltests vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Design stützte sich auf die frühere Studie von Metz und Whishaw, die über die Nützlichkeit des “Leitersprossen-Gehtests” berichteten13,14. Sie entwarfen den Leitersprossen-Gehtest, um das geschickte Gehen zu bewerten und sowohl die Platzierung der Vorder- als auch der Hintergliedmaßen, das Treten und die Koordination zwischen den Gliedmaßen zu messen, indem sie von den Tieren verlangten, auf einer horizontalen Leiter …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI unterstützt (Förderkennzeichen 18H03379 an N.K., 21K15340 an I.A. und 22J11280 an A.N.).
Materials
| Air puff | DAISO | ||
| Aluminum sticks | CAINZ | 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval). | |
| Blutack | Bostik | ||
| Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each | |
| Screws | CAINZ |
References
- Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
- Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
- Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17 (2010).
- Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342 (2022).
- Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
- Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119 (2022).
- Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
- Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118 (2021).
- Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010 (2022).
- Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
- Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).
