Een veelzijdige, gedragsmethode om de effecten van schildklierhormoon op de cerebellaire functie te onderzoeken
Summary
Hier presenteren we een protocol voor een veelzijdige gedragstest die onlangs is ontwikkeld, de ladderbalktest. Deze test heeft het voordeel dat subtiele cerebellaire ataxie wordt gedetecteerd die wordt veroorzaakt door een defect in de werking van het schildklierhormoon in het centrale zenuwstelsel ten opzichte van de conventionele gedragstests die de motorische prestaties beoordelen.
Abstract
De werking van schildklierhormoon (TH) is essentieel tijdens de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, inclusief het cerebellum. In het geval van TH-deficiëntie in het vroege leven, zoals congenitale hypothyreoïdie, vertonen patiënten neurologische aandoeningen zoals cognitieve retardatie en motorische stoornissen. Er zijn verschillende onderzoeken waarbij gebruik wordt gemaakt van muismodellen met weefsel- of celspecifieke TH-deficiëntie om de rol van TH in het cerebellum te onderzoeken. Vergeleken met gegeneraliseerde congenitale hypothyreoïdiemuizen, vertonen cerebellaire celspecifieke TH-deficiënte muizen mildere en subtielere ataxische kenmerken, waardoor de beoordeling van de motorische functie moeilijk wordt bij gebruik van conventionele tests zoals de rotarod-test.
Vanwege de behoefte aan een alternatief hulpmiddel om de motorische functie in TH-gerelateerde diermodellen te beoordelen, hebben we een veelzijdige gedragsmethode ontwikkeld, de “ladderstraaltest”, waarin we de verschillende laddertests kunnen ontwerpen afhankelijk van de ernst van ataxie bij modelmuizen. We gebruikten transgene muizen die een dominant-negatieve TH-receptor tot expressie brachten, specifiek in de cerebellaire Purkinje-cel, een enig outputneuron in de cerebellaire cortex dat motorische prestaties moduleert. De nieuw gebouwde ladderstraaltest detecteerde met succes robuuste stoornissen in motorische prestaties bij de transgene muizen op een hoger niveau in vergelijking met de rotarod-test. Verstoring van motorisch leren werd ook gedetecteerd in de ladderbalktest, maar niet in de rotarod-test. Het protocol met dit nieuwe gedragsapparaat kan worden toegepast op andere diermodellen die een mild ataxisch fenotype kunnen vertonen om subtiele veranderingen in de cerebellaire functie te onderzoeken.
Introduction
Schildklierhormoon (TH) is onmisbaar voor de ontwikkeling van de hersenen1. In het bijzonder is de rol ervan in het cerebellum van cruciaal belang omdat TH-deficiëntie in het vroege leven een afwijkende cerebellaire ontwikkeling veroorzaakt 1,2. Bij congenitale hypothyreoïdie vertonen patiënten bijvoorbeeld een reeks neurologische retardaties, waaronder cognitieve en motorische stoornissen. Om de rol van TH in de functionele ontwikkeling van de cerebellaire hersenen te onthullen, hebben sommige studies TH-deficiëntie op een cerebellaire celspecifieke manier beperkt4. Echter, in vergelijking met gegeneraliseerde congenitale hypothyreoïdie muizen, waarbij alle weefsels en cellen worden aangetast door TH-deficiëntie, vertonen dergelijke cerebellaire-specifieke modellen zo subtiele ataxie dat de conventionele gedragstests, zoals rotarod-, voetafdruk- en evenwichtsbalktests, de verschillen nauwelijks detecteren. Om de TH-effecten op de cerebellaire functie volledig te onderzoeken, is dus een nieuw beoordelingsinstrument nodig om een subtiele verandering in de motorische coördinatie van modelmuizen te detecteren.
De rotarod-test is het meest gebruikte hulpmiddel voor het beoordelen van motorische coördinatie, oorspronkelijk ontwikkeld door Dunham en Miya5 en later toegepast op een versnellende versie door Jones en Roberts6. De latentie om van de roterende staaf te vallen wordt geïnterpreteerd als de test voor motorische coördinatie, en de eenvoud en beknoptheid ervan maken het vaak gebruikt door gedragsonderzoekers die de motorische functie bestuderen7. Het gebruiksgemak van deze test is echter een tweesnijdend zwaard. Doordat de stang automatisch draait, kunnen muizen zich vastklampen aan de draaiende stang en deze blijven zitten zonder te bewegen. Bovendien kunnen muizen van plan zijn eraf te vallen in plaats van op de roterende staaf te blijven balanceren. In beide situaties zijn de validiteit en betrouwbaarheid van de test twijfelachtig voor het beoordelen van “zuivere motorische coördinatie”7. Met andere woorden, het richt zich niet nauwkeurig op de cerebellaire functie en omvat andere factoren zoals spierkracht om vast te grijpen.
In plaats van de conventionele hulpmiddelen voor motorische coördinatiebeoordeling, presenteren we hier een nieuwe gedragstest genaamd de “ladderstraaltest”, die onlangs in ons laboratorium is ontwikkeld. De horizontale ladderlooptest is ontworpen om cerebellum-gerelateerde complexe motorische vaardigheden te beoordelen: feed-forward voorspelling en integratie van beweging8. Het testapparaat bestond uit vier stukken plexiglas met gaten (Figuur 1). De vier platen werden parallel verbonden door schroeven en stokken die in de gaten van de platen werden gestoken. Twee buitenplaten werden gebruikt om het apparaat te stabiliseren en twee binnenplaten werden gebruikt om de verschillende soorten laddersporten te ontwerpen (Figuur 2C). De breedte van de sport werd aangepast afhankelijk van de grootte van het dier om het achteruit bewegen van de dieren te minimaliseren (Figuur 2B). De afstand van het startpunt tot het doel was 110 cm. Het apparaat bevond zich 60 cm boven de bank en er werd een veiligheidskussen onder het apparaat geplaatst (Figuur 2A). De donkere kamer werd in de buurt van het doel geplaatst om de dieren te motiveren om naar het doel te bewegen (Figuur 2A).
We onderzochten de TH-effecten op de functionele ontwikkeling van de cerebellaire hersenen door gebruik te maken van transgene muizen die dominant-negatieve TH-receptor (TR) tot expressie brengen in cerebellaire Purkinje-cellen (Mf-1/FVB-muizen). In zowel rotarod- als ladderstraaltests hebben we een cerebellair ataxisch fenotype waargenomen bij Mf-1/FVB-muizen; de ladderstraaltest slaagde er echter in om meer significante verschillen te detecteren dan de rotarod-test (figuur 3). Bovendien kan het motorisch leervermogen grondiger worden beoordeeld in een ladderbalktest (Figuur 3B,C). Als cellulaire achtergrond van een dergelijk gedragsfenotype werd de inductie van langdurige depressie (LTD) geremd en in plaats daarvan werd langdurige potentiëring (LTP) geïnduceerd na een LTD-inductieve stimulatie in Mf-1/FVB Purkinje-cellen9. LTD is essentieel voor motorische coördinatie en motorisch leren in het cerebellum10. Veel studies hebben motorische tekorten en remming van LTD gerapporteerd bij knock-out of gemuteerde muizen voor belangrijke regulatorgenen in de cerebellaire functie, maar geen enkele studie heeft ooit de inductie van LTP gerapporteerd na een LTD-inductieve stimulatie 11,12. Alles bij elkaar genomen kan dit fenomeen uniek zijn voor Mf-1/FVB-muizen of TH-deficiënte muizen (hetzelfde fenomeen werd waargenomen bij muizen met hypothyreoïdie op volwassen leeftijd), wat suggereert dat TH de cerebellaire functie anders reguleert dan de andere belangrijke eiwitten. Als dat zo is, is het aannemelijk dat muizen met abnormale TH-actie niet op dezelfde manier cerebellaire ataxie vertonen als andere modelmuizen. Dit benadrukt nogmaals de noodzaak van een specifieke methode voor het beoordelen van TH-effecten op de cerebellaire functie. Dit artikel presenteert een nieuw protocol om TH-effecten op de cerebellaire functie te onderzoeken met behulp van de nieuw gebouwde ladderbalktest.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons ontwerp was gebaseerd op de eerdere studie van Metz en Whishaw, die het nut van “de ladder-sport looptest” rapporteerden13,14. Ze ontwierpen de ladder-sport looptest om bekwaam lopen te beoordelen en zowel de plaatsing van de voorpoten als de achterpoten, stappen en coördinatie tussen de ledematen te meten door dieren te verplichten van een startpunt naar een doel op een horizontale ladder te lopen13,14</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (subsidienrs. 18H03379 aan N.K., 21K15340 aan I.A. en 22J11280 aan A.N.).
Materials
| Air puff | DAISO | ||
| Aluminum sticks | CAINZ | 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval). | |
| Blutack | Bostik | ||
| Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each | |
| Screws | CAINZ |
References
- Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
- Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
- Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17 (2010).
- Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342 (2022).
- Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
- Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119 (2022).
- Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
- Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118 (2021).
- Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010 (2022).
- Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
- Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).
