JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Abstract

Çözünen taşıyıcılar (SLC’ler), iyonlar, besinler, metabolitler, nörotransmiterler ve farmasötikler dahil olmak üzere bir dizi endojen ve eksojen substratı ithal ve ihraç eden membran taşıyıcılardır. Çekici terapötik hedefler ve hastalık belirteçleri olarak ortaya çıkmasına rağmen, bu protein grubu hala mevcut farmasötikler tarafından nispeten yetersiz ilaçlanmaktadır. Bu taşıyıcılar için ilaç keşif projeleri, nihayetinde bu zara gömülü protein sınıfının ekspresyonu ve saflaştırılmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlı yapısal, işlevsel ve fizyolojik bilgi tarafından engellenmektedir. Burada, kodon için optimize edilmiş gen dizilerini kullanarak yüksek saflıkta, miligram miktarlarda insan SLC taşıyıcı proteinleri elde etme yöntemlerini gösteriyoruz. Yapı tasarımının ve yüksek verimli ekspresyonun sistematik bir şekilde araştırılması ile bağlantılı olarak, bu protokoller hedef proteinlerin yapısal bütünlüğünün ve biyokimyasal aktivitesinin korunmasını sağlar. Ayrıca, bu proteinlerin ökaryotik hücre ekspresyonu, afinite saflaştırması ve boyut dışlama kromatografisindeki kritik adımları da vurguluyoruz. Sonuç olarak, bu iş akışı, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme, taşıma çalışmaları, küçük moleküllü etkileşim testleri ve yüksek verimli in vitro tarama için uygun saf, işlevsel olarak aktif ve stabil protein preparatları sağlar.

Introduction

Membran proteinleri uzun zamandır hem araştırmacılar hem de ilaç endüstrileri için hedef olmuştur. Bunlardan çözünen taşıyıcılar (SLC’ler), insan genomu1 içinde kodlanmış 400’den fazla ikincil taşıyıcı genden oluşan bir ailedir. Bu taşıyıcılar, iyonlar2, nörotransmiterler3, lipitler 4,5,6,7, amino asitler 8, besinler9,10,11 ve farmasötikler 12 dahil olmak üzere çok sayıda molekülün ithalat ve ihracatında yer almaktadır. Bu kadar geniş bir substrat yelpazesine sahip olan bu proteinler, toksinlerin taşınması13, kötüye kullanım ilaçlarınıntaşınması ve inhibisyonu 14,15 veya zararlı mutasyonlar 16 yoluyla bir dizi patofizyolojide de rol oynar. Bakteriyel homologlar, çeşitli SLC ailelerinin temel taşıma mekanizması için prototip görevi görmüştür 17,18,19,20,21,22,23,24,25. İnsan proteinlerinin aksine, prokaryotik ortologlar genellikle iyi anlaşılmış Escherichia coli ekspresyon sisteminde26,27 daha iyi ifade edilir ve X-ışını kristalografisi28 için iyi düzenlenmiş kristaller veren daha küçük deterjanlarda daha kararlıdır. Bununla birlikte, dizi ve fonksiyonel farklılıklar, bu uzaktan ilişkili proteinlerin ilaç keşfi için kullanımını zorlaştırmaktadır29,30. Sonuç olarak, SLC’leri hedef alan ilaçların etki mekanizmasını deşifre etmek için genellikle insan proteininin doğrudan incelenmesi gerekir 31,32,33,34,35. Kriyo-elektron Mikroskobu’ndaki (Cryo-EM) son gelişmeler, SLC’lerin daha doğal benzeri koşullarda yapısal karakterizasyonunu mümkün kılarken,36,37, bu proteinleri ifade etme ve saflaştırmadaki zorluk, hedeflenen terapötikler ve teşhisler geliştirmek için bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Bu zorluğu hafifletmek için, RESOLUTE konsorsiyumu (re-solute.eu), insan SLC ailesi proteinlerinin büyük ölçekli ekspresyonu ve saflaştırılması için kaynaklar ve protokoller geliştirmiştir38. Kodon için optimize edilmiş genlerden başlayarak, SLC yapılarının yüksek verimli klonlanması ve taranması için yöntemler geliştirdik. Bu yöntemler sistematik olarak tüm SLC ailesine uygulandı, genler BacMam viral ekspresyon sistemine klonlandı ve protein ekspresyonu, yüksek verimli klonlama ve ekspresyon testi40 için daha önce açıklanan yöntemlere dayalı olarak insan hücre hatlarında39 test edildi. Özetle, SLC geni pDONR221 plazmitinden bir pHTBV1.1 vektörüne klonlanır. Bu yapı daha sonra, memeli hücrelerinde ekspresyon için bir sitomegalovirüs promotörü ve arttırıcı elementler içeren böcek hücrelerini transfekte etmek için ilgilenilen geni bir bacmid vektörüne aktarmak için kullanılır. Elde edilen bakulovirüs, hedef SLC proteininin ekspresyonu için memeli hücrelerini dönüştürmek için kullanılabilir.

Ayrıca, seçilen SLC’lerin büyük ölçekli ekspresyonu ve stabil saflaştırılması için standartlaştırılmış yöntemler geliştirdik (Şekil 1). Bu protokol, etkili sorun gidermeyi kolaylaştırmak ve deneyler arasındaki değişkenliği en aza indirmek için birden fazla kontrol noktası içerir. Özellikle, protein ekspresyonunun ve lokalizasyonunun rutin olarak izlenmesinin yanı sıra bireysel hedefler için saflaştırma koşullarının küçük ölçekli optimizasyonu, Strep ve Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketleri41,42 tarafından desteklenmiştir.

Sonuç olarak, bu kimyasal olarak saf ve yapısal olarak homojen protein örnekleri, X-ışını kristalografisi veya Kriyo-Elektron Mikroskobu (Cryo-EM) ile yapısal belirleme, biyokimyasal hedef-angajman deneyleri, bağlayıcı üretimi için bağışıklama ve kimyasal olarak tanımlanmış lipozomlara sulandırma yoluyla hücresiz fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir.

Protocol

NOT: Tüm kodon için optimize edilmiş RESOLUTE SLC genleri, bağlantıları RESOLUTE genel reaktifleri44 listesinde bulunan AddGene43’e yatırılmıştır. Bu genler pDONR221 plazmidine klonlanmıştır ve rekombinasyon klonlaması45 kullanılarak genlerin hedef vektöre doğrudan klonlanmasına izin verir. Paralelliği en üst düzeye çıkarmak için, bakteriyel, böcek ve memeli hücreleri, sırasıyla bakmid üretimi (bölüm 3), bakulovirüs a…

Representative Results

SLC genleri, memeli ekspresyonu için RESOLUTE pDONR plazmitlerinden BacMam vektörlerine klonlanabilirKlonlama, ekspresyon ve saflaştırma için açıklanan protokollerin, çoklu protein kıvrımları boyunca birçok SLC taşıyıcısı için başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, prosedürler, ilerlemeyi izlemek için çeşitli kontrol noktaları içerir ve ekspresyon, protein katlanması, lipid ve deterjana bağlı stabilite ve tampon koşullarına duyarlılıktaki farklılıkl…

Discussion

SLC hedefli tedavilerin geliştirilmesi, taşıyıcı fonksiyonun sistematik karakterizasyonunun olmaması nedeniyle engellenmiştir. Bu, normal ve patofizyolojik süreçlerdeki sayısız rollerine rağmen, GPCR’lere ve iyon kanallarına63 göre bu protein sınıfını hedef alan orantısız olarak daha az ilaca yol açmıştır. RESOLUTE, mevcut SLC araştırmalarını hızlandırmak ve geliştirmek için en son araştırma tekniklerini ve araçlarını geliştirmeyi amaçlayan uluslararası bir …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma RESOLUTE projesi kapsamında gerçekleştirilmiştir. RESOLUTE, Yenilikçi İlaçlar Girişimi 2 Ortak Girişimi’nden 777372 No’lu hibe sözleşmesi kapsamında fon almıştır. Bu Ortak Girişim, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı ve EFPIA’dan destek almaktadır. Bu makale yalnızca yazarların görüşlerini yansıtmaktadır ve ne IMI ne de Avrupa Birliği ve EFPIA, burada yer alan bilgilerin herhangi bir şekilde kullanılmasından sorumlu değildir. pHTBV plazmidi Prof. Frederick Boyce (Harvard) tarafından sağlanmıştır.

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -. N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl–dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. . Resolute Public Reagents Available from: https://re-solute.eu/resources/reagents (2023)
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -. N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochimie. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -. P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

Solute CarriersSLCsMembrane TransportersDrug DiscoveryHigh-throughput ExpressionProtein PurificationStructural StudiesBiochemical StudiesReSOLUTEBacMam Expression SystemCryo-EM

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image