Высокопроизводительная экспрессия и очистка носителей растворенных веществ человека для структурных и биохимических исследований

Мембранные белки уже давно являются мишенью как для исследователей, так и для фармацевтической промышленности. Из них растворенные носители (SLC) представляют собой семейство из более чем 400 вторичных генов-переносчиков, закодированных в геноме человека¹. Эти переносчики участвуют в импорте и экспорте многочисленных молекул, включая ионы², нейротрансмиттеры³, липиды 4,5,6,7, аминокислоты⁸, питательные вещества 9,10,11 и фармацевтические препараты ¹². При такой широте субстратов эти белки также вовлечены в целый ряд патофизиологий через транспорт токсинов¹³, транспорт и ингибирование наркотиками ^14,15 или вредные мутации¹⁶. Бактериальные гомологи послужили прототипами фундаментального транспортного механизма нескольких семейств SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. В отличие от белков человека, прокариотические ортологи часто лучше экспрессируются в хорошо изученной системе экспрессии Escherichia coli 26,27 и более стабильны в более мелких детергентах^, которые дают хорошо упорядоченные кристаллы для рентгеновской кристаллографии²⁸. Однако последовательности и функциональные различия затрудняют использование этих отдаленно родственных белков для разработки лекарств^29,30. Следовательно, для расшифровки механизма действия препаратов, нацеленных на SLC 31,32,33,34,35^, часто требуется непосредственное изучение белка человека. Несмотря на то, что недавние достижения в области криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ) позволили охарактеризовать структурные СЛК в условиях, приближенных к нативным^36,37, трудности с экспрессией и очисткой этих белков остаются проблемой для разработки таргетной терапии и диагностики.

Чтобы решить эту проблему, консорциум RESOLUTE (re-solute.eu) разработал ресурсы и протоколы для крупномасштабной экспрессии и очистки белков семейства SLC^{человека 38}. Начав с кодон-оптимизированных генов, мы разработали методы высокопроизводительного клонирования и скрининга SLC-конструкций. Эти методы систематически применялись ко всему семейству SLC, гены клонировались в систему вирусной экспрессии BacMam, а экспрессия белка тестировалась на клеточных линиях человека³⁹ на основе ранее описанных методов высокопроизводительного клонирования и тестирования экспрессии⁴⁰. Таким образом, ген SLC клонируется из плазмиды pDONR221 в вектор pHTBV1.1. Эта конструкция впоследствии используется для транспонирования интересующего гена в бакмидный вектор для трансфекции клеток насекомых, который включает промотор цитомегаловируса и элементы энхансера для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный бакуловирус может быть использован для трансдукции клеток млекопитающих для экспрессии белка-мишени SLC.

Кроме того, мы разработали стандартизированные методы для крупномасштабной экспрессии и стабильной очистки выбранных SLC (рис. 1). Этот протокол включает в себя несколько контрольных точек, что облегчает эффективное устранение неполадок и сводит к минимуму вариативность между экспериментами. В частности, рутинный мониторинг экспрессии и локализации белков, а также мелкомасштабная оптимизация условий очистки для отдельных мишеней были поддержаны метками стрептококка и зеленого флуоресцентного белка (GFP)^41,42.

В конечном счете, эти химически чистые и структурно однородные образцы белков могут быть использованы для структурного определения с помощью рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ), биохимических анализов взаимодействия с мишенями, иммунизации для генерации связующего и внеклеточных функциональных исследований путем восстановления в химически определенные липосомы.