用于结构和生化研究的人溶质载体的高通量表达和纯化

长期以来，膜蛋白一直是研究人员和制药行业的目标。其中，溶质载体 （SLC） 是一个由人类基因组中编码的 400 多个次级转运蛋白基因组成的家族¹。这些转运蛋白参与许多分子的进出口，包括离子²、神经递质³、脂质⁴、⁵、⁶、⁷、氨基酸⁸、营养素⁹、10^、11 和药物 ¹²。由于底物如此广泛，这些蛋白质还通过毒素 13 的转运、滥用药物^14、15 的转运和抑制或有害突变¹⁶ 与一系列病理生理学有关。细菌同源物已成为几个SLC家族17,18,19,20,21,22,23,24,25的基本运输机制的原型。与人类蛋白质相比，原核直系同源物通常在众所周知的大肠杆菌表达系统^26,27 中表达得更好，并且在较小的去污剂中更稳定^，这些去污剂产生用于 X 射线晶体学的有序晶体²⁸。然而，序列和功能差异使这些远缘相关蛋白质用于药物发现变得复杂^29,30。因此，通常需要对人类蛋白质进行直接研究，以破译靶向 SLC³¹、32、³³、^34、35 的药物的作用机制。虽然冷冻电子显微镜 （Cryo-EM） 的最新进展使得在更天然的类似条件下对 SLC 进行结构表征^36,37，但表达和纯化这些蛋白质的困难仍然是开发靶向治疗和诊断的挑战。

为了缓解这一挑战，RESOLUTE联盟（re-solute.eu）开发了用于大规模表达和纯化人SLC家族蛋白的资源和方案³⁸。从密码子优化基因开始，我们开发了用于SLC构建体的高通量克隆和筛选方法。这些方法被系统地应用于整个SLC家族，将基因克隆到BacMam病毒表达系统中，并基于先前描述的高通量克隆和表达测试^方法40，在人类细胞系³⁹中测试蛋白质表达。总之，SLC 基因从 pDONR221 质粒克隆到 pHTBV1.1 载体中。该构建体随后用于将目的基因转置到用于转染昆虫细胞的杆粒载体中，其中包括用于在哺乳动物细胞中表达的巨细胞病毒启动子和增强子元件。所得杆状病毒可用于转导哺乳动物细胞以表达靶标SLC蛋白。

我们进一步开发了用于大规模表达和稳定纯化选定SLC的标准化方法（图1）。该协议包括多个检查点，以促进有效的故障排除并最大限度地减少实验之间的差异。值得注意的是，链球菌和绿色荧光蛋白 （GFP） 标签^41,42 有助于蛋白质表达和定位的常规监测^，以及单个靶标纯化条件的小规模优化。

最终，这些化学纯度和结构均质的蛋白质样品可用于通过 X 射线晶体学或冷冻电子显微镜 （Cryo-EM） 进行结构测定、生化靶标结合测定、免疫以生成粘合剂，以及通过复溶到化学定义的脂质体中进行无细胞功能研究。