Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Las proteínas de membrana han sido durante mucho tiempo objetivos tanto para los investigadores como para las industrias farmacéuticas. De estos, los portadores de solutos (SLC) son una familia de más de 400 genes transportadores secundarios codificados dentro del genoma^humano. Estos transportadores están involucrados en la importación y exportación de numerosas moléculas, incluidos iones², neurotransmisores³, lípidos 4,5,6,7, aminoácidos⁸, nutrientes 9,10,11 y productos farmacéuticos ¹². Con tal amplitud de sustratos, estas proteínas también están implicadas en una serie de fisiopatologías a través del transporte de toxinas¹³, el transporte y la inhibición por drogas de abuso ^14,15 o mutaciones deletéreas¹⁶. Los homólogos bacterianos han servido como prototipos para el mecanismo de transporte fundamental de varias familias de SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. A diferencia de las proteínas humanas, los ortólogos procariotas a menudo se expresan mejor en el bien conocido sistema de expresión de Escherichia coli ^26,27 y son más estables en los detergentes más pequeños que producen cristales bien ordenados para la cristalografía de rayos X ²⁸. Sin embargo, las diferencias de secuencia y funcionales complican el uso de estas proteínas lejanamente relacionadas para el descubrimiento de fármacos^29,30. En consecuencia, a menudo se necesita un estudio directo de la proteína humana para descifrar el mecanismo de acción de los fármacos dirigidos a las SLC 31,32,33,34,35. Si bien los avances recientes en criomicroscopía electrónica (Cryo-EM) han permitido la caracterización estructural de las SLC en condiciones más nativas^36,37, la dificultad para expresar y purificar estas proteínas sigue siendo un desafío para el desarrollo de terapias y diagnósticos dirigidos.

Para paliar este reto, el consorcio RESOLUTE (re-solute.eu) ha desarrollado recursos y protocolos para la expresión y purificación a gran escala de proteínas humanas de la familia SLC³⁸. A partir de genes optimizados para codones, hemos desarrollado métodos para la clonación de alto rendimiento y el cribado de construcciones de SLC. Estos métodos se aplicaron sistemáticamente a toda la familia de SLC, los genes se clonaron en el sistema de expresión viral BacMam y la expresión de proteínas se probó en líneas celulares humanas³⁹ sobre la base de métodos descritos anteriormente para la clonación de alto rendimiento y las pruebas de expresión⁴⁰. En resumen, el gen SLC se clona a partir del plásmido pDONR221 en un vector pHTBV1.1. Esta construcción se utiliza posteriormente para transponer el gen de interés en un vector bacmid para la transfección de células de insectos, que incluye un promotor de citomegalovirus y elementos potenciadores para su expresión en células de mamíferos. El baculovirus resultante se puede utilizar para transducir células de mamíferos para la expresión de la proteína SLC diana.

Además, desarrollamos métodos estandarizados para la expresión a gran escala y la purificación estable de SLC seleccionadas (Figura 1). Este protocolo incluye varios puntos de control para facilitar la resolución eficaz de problemas y minimizar la variabilidad entre experimentos. En particular, el monitoreo rutinario de la expresión y localización de proteínas, así como la optimización a pequeña escala de las condiciones de purificación para objetivos individuales, se vieron ayudados por las etiquetas Strep y Green Fluorescent Protein (GFP)^41,42.

En última instancia, estas muestras de proteínas químicamente puras y estructuralmente homogéneas se pueden utilizar para la determinación estructural mediante cristalografía de rayos X o criomicroscopía electrónica (Cryo-EM), ensayos bioquímicos de compromiso con dianas, inmunización para la generación de aglutinantes y estudios funcionales libres de células mediante la reconstitución en liposomas químicamente definidos.