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Biochimie

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
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1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

Abstract

용질 담체(SLC)는 이온, 영양소, 대사 산물, 신경 전달 물질 및 의약품을 포함한 다양한 내인성 및 외인성 기질을 수입 및 수출하는 막 수송체입니다. 매력적인 치료 표적 및 질병 표지자로 부상했음에도 불구하고 이 단백질 그룹은 여전히 현재 의약품에 비해 상대적으로 약이 부족합니다. 이러한 수송체에 대한 약물 발견 프로젝트는 제한된 구조적, 기능적, 생리학적 지식으로 인해 방해를 받으며, 궁극적으로 이러한 종류의 막에 내장된 단백질의 발현 및 정제의 어려움으로 인해 방해를 받습니다. 여기서는 코돈에 최적화된 유전자 염기서열을 사용하여 고순도 밀리그램 양의 인간 SLC 수송체 단백질을 얻는 방법을 보여줍니다. 구조 설계 및 고처리량 발현에 대한 체계적인 탐색과 함께 이러한 프로토콜은 표적 단백질의 구조적 무결성 및 생화학적 활성의 보존을 보장합니다. 또한 진핵생물 세포 발현, 친화성 정제 및 이러한 단백질의 크기 배제 크로마토그래피에서 중요한 단계를 강조합니다. 궁극적으로 이 워크플로우는 고분해능 구조 측정, 수송 연구, 저분자 관여 분석 및 고처리량 in vitro 스크리닝에 적합한 순수하고 기능적으로 활성화되며 안정적인 단백질 제제를 제공합니다.

Introduction

막 단백질은 오랫동안 연구자와 제약 산업 모두의 표적이 되어 왔습니다. 이 중 용질 운반체(SLC)는 인간 게놈1 내에 암호화된 400개 이상의 2차 수송체 유전자 계열입니다. 이러한 수송체는 이온2, 신경 전달 물질3, 지질 4,5,6,7, 아미노산8, 영양소 9,10,11 및 의약품 12을 포함한 수많은 분자의 수입 및 수출에 관여합니다. 이러한 광범위한 기질로 인해, 이들 단백질은 독소의 수송(13), 남용 약물(14,15)에 의한 운반 및 억제, 또는 해로운 돌연변이(16)의 운반을 통해 다양한 병태생리학에 관여한다. 박테리아 상동체는 여러 SLC 계열(17,18,19,20,21,22,23,24,25)의 기본 수송 메커니즘의 프로토타입 역할을 해왔다. 인간 단백질과는 대조적으로, 원핵생물 ortholog는 종종 잘 이해된 대장균 발현 시스템(26,27)에서 더 잘 발현되며, X선 결정학(28)을 위해 잘 정돈된 결정을 생성하는 더 작은 세제에서 더 안정적이다. 그러나, 순서와 기능적인 다름은 약 발견을 위한 이 먼 관련된 단백질의 사용을 복잡하게 한다29,30. 결과적으로, 인간 단백질의 직접적인 연구는 종종 SLC 31,32,33,34,35를 표적으로 하는 약물의 작용 메커니즘을 해독하는 데 필요합니다. 최근 Cryo-electron Microscopy(Cryo-EM)의 발전으로 보다 네이티브와 유사한 조건에서 SLC의 구조적 특성 분석이 가능해졌지만(36,37), 이러한 단백질을 발현하고 정제하는 데 어려움이 있어 표적 치료제 및 진단 개발에 있어 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.

이러한 문제를 완화하기 위해 RESOLUTE 컨소시엄(re-solute.eu)은 인간 SLC 계열 단백질의 대규모 발현 및 정제를 위한 리소스와 프로토콜을 개발했습니다38. 코돈에 최적화된 유전자를 시작으로 SLC 구조체의 고처리량 클로닝 및 스크리닝을 위한 방법을 개발했습니다. 이러한 방법은 SLC의 전체 패밀리에 체계적으로 적용되었고, 유전자는 BacMam 바이러스 발현 시스템으로 클로닝되었으며, 단백질 발현은 고처리량 클로닝 및 발현 테스트(40)를 위해 이전에 기술된 방법에 기초하여 인간 세포주(39)에서 테스트되었습니다. 요약하면, SLC 유전자는 pDONR221 플라스미드에서 pHTBV1.1 벡터로 클로닝됩니다. 이 작제물은 이어서 관심 유전자를 곤충 세포를 형질주입하기 위한 bacmid 벡터로 전치하는데 사용되며, 이는 포유류 세포에서의 발현을 위한 거대세포바이러스 프로모터 및 인핸서 요소를 포함한다. 생성된 바큘로바이러스는 표적 SLC 단백질의 발현을 위해 포유류 세포를 형질도입하는 데 사용할 수 있습니다.

또한 선별된 SLC의 대규모 발현 및 안정적인 정제를 위한 표준화된 분석법을 개발했습니다(그림 1). 이 프로토콜에는 효과적인 문제 해결을 촉진하고 실험 간의 변동성을 최소화하기 위한 여러 체크포인트가 포함되어 있습니다. 특히, 단백질 발현 및 국소화의 일상적인 모니터링과 개별 표적에 대한 정제 조건의 소규모 최적화는 Strep 및 Green Fluorescent Protein(GFP) 태그41,42의 도움을 받았습니다.

궁극적으로, 화학적으로 순수하고 구조적으로 균질한 이러한 단백질 샘플은 X선 결정학 또는 초저온 전자 현미경(Cryo-EM)을 통한 구조 측정, 생화학적 표적 결합 분석, 바인더 생성을 위한 면역 및 화학적으로 정의된 리포좀으로의 재구성을 통한 무세포 기능 연구에 사용할 수 있습니다.

Protocol

참고: 모든 코돈에 최적화된 RESOLUTE SLC 유전자는 AddGene43에 증착되었으며, 이 링크는 RESOLUTE 공공 시약44 목록에서 확인할 수 있습니다. 이들 유전자는 pDONR221 플라스미드로 클로닝되어 재조합 클로닝(45)을 이용하여 유전자를 목적 벡터로 직접 클로닝할 수 있다. 병렬성을 극대화하기 위해 박테리아, 곤충 및 포유류 세포는 각각 bacmid 생산(섹션 3)…

Representative Results

포유류 발현을 위해 SLC 유전자를 RESOLUTE pDONR 플라스미드에서 BacMam 벡터로 클로닝할 수 있습니다.클로닝, 발현 및 정제를 위해 설명된 프로토콜은 여러 단백질 접힘에 걸쳐 많은 SLC 수송체에 대해 성공적인 것으로 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고 이 절차에는 진행 상황을 모니터링하기 위한 몇 가지 체크포인트가 포함되어 있어 발현, 단백질 접힘, 지질 및 세제 의존적 안정성, …

Discussion

SLC 표적 치료제의 개발은 수송체 기능의 체계적인 특성 분석의 부재로 인해 방해를 받고 있습니다. 이로 인해 정상 및 병태생리학적 과정에서의 수많은 역할에도 불구하고 GPCR 및 이온 채널63에 비해 이 단백질 클래스를 표적으로 하는 약물이 불균형적으로 적어졌습니다. RESOLUTE는 현재 SLC 연구를 가속화하고 개선하기 위한 최첨단 연구 기법과 도구를 개발하는 것을 목표로 하는 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 RESOLUTE 프로젝트의 일환으로 수행되었습니다. RESOLUTE는 보조금 계약 No 777372에 따라 Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking으로부터 자금을 지원받았습니다. 이 공동 사업은 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램과 EFPIA의 지원을 받습니다. 이 기사는 저자의 견해만을 반영하며, IMI나 유럽연합 및 EFPIA는 이 글에 포함된 정보의 사용에 대해 책임을 지지 않습니다. pHTBV 플라스미드는 Frederick Boyce 교수(하버드)가 친절하게 제공하였습니다.

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
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Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
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