Farelerde Dolaşımdaki Luteinize Edici Hormonu İndüklemek ve Ölçmek için Otomatik Kan Örneklemesi ile Birleştirilmiş Uzaktan Nöronal Aktivasyon
Summary
Luteinize edici hormon (LH) pulsatilitesi, üreme fonksiyonunun ayırt edici özelliğidir. Seri otomatik kan alımına bağlı belirli nöronal popülasyonların uzaktan aktivasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Bu teknik, bilinçli serbest hareket eden ve rahatsız edilmemiş hayvanlarda zamanlanmış hormonal modülasyona, çoğullamaya ve LH seviyeleri üzerindeki manipülasyon etkilerini en aza indirmeye izin verir.
Abstract
Dolaşımdaki luteinize edici hormon (LH) seviyeleri, üremenin hipotalamik-hipofiz kontrolünün işleyişinin önemli bir indeksidir. LH salınımının modülasyonunda çok sayıda girdinin ve nöronal popülasyonun rolü hala bilinmemektedir. Farelerde LH seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek, çevresel stres tarafından kolayca bozuldukları için genellikle zor bir iştir. LH salınımını ve pulsatiliteyi ölçmek için mevcut teknikler, farelerin manipülasyon stresine, belirli kısıtlamalara, araştırmacının varlığına ve bireysel hayvanlar üzerinde çalışmaya uyum sağlamaları için uzun süreli eğitim gerektirir ve bu da birçok araştırma sorusu için kullanışlılığını azaltır.
Bu makale, bilinçli, serbestçe hareket eden ve rahatsız edilmemiş farelerde otomatik sıralı kan örneklemesi ile birlikte Tasarımcı İlaçlar Tarafından Özel Olarak Aktive Edilen Tasarımcı Reseptörü (DREADD’ler) teknolojisini kullanarak belirli nöronal popülasyonları uzaktan aktive etmek için bir teknik sunmaktadır. İlk olarak, DREADD’leri eksprese eden adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörlerini spesifik nöronal popülasyonlara iletmek için stereotaksik cerrahi protokolünü tanımladık. Daha sonra, karotis arter ve juguler ven kanülasyonu ve CULEX otomatik kan örnekleme sistemine cerrahi sonrası bağlantı için protokolü açıklıyoruz. Son olarak, uzaktan nöronal aktivasyon ve otomatik kan toplama için klozapin-N-oksit intravenöz enjeksiyon protokolünü açıklıyoruz. Bu teknik, belirli bir süre boyunca her 5 dakikada bir veya daha uzun sürede, istenen bir zaman noktasında veya süresinde intravenöz madde enjeksiyonu ile birlikte programlanmış otomatik örneklemeye izin verir. Genel olarak, bu tekniğin nöroendokrin kontrol üzerine araştırmalar için güçlü bir yaklaşım olduğunu gördük.
Introduction
Hipotalamo-hipofiz-gonadal (HPG) ekseni, gonadotropin salgılatıcı hormonun (GnRH) hipofiz portal sistemine pulsatil salınımı ile merkezi olarak düzenlenir. Hipofiz bezinde GnRH, gonadotropinlerin, luteinize edici hormonun (LH) ve folikül uyarıcı hormonun (FSH) dolaşım sistemine pulsatil salınımını kontrol eder. LH pulsatil salınımı, 1,2,3,4 işleyen merkezi HPG ekseni için bir ayırt edici özellik görevi görür. Örneğin, genetik değişikliklerin veya hormonal veya çevresel faktörlerdeki değişikliklerineksen 5,6,7’nin nöral kısmı üzerindeki etkilerini gösterir. Yakın zamana kadar, LH pulsatil paterninin ölçülmesi, yüksek örnekleme sıklığı ve nabızları tanımlamak için gerekli olan büyük kan hacimleri göz önüne alındığında, büyük memeliler8 ve sıçanlar9 ile sınırlıydı.
Farelerde LH darbelerinin tespit edilmesi arzu edilir, çünkü bu tür geniş genetik modellere sahiptir ve spesifik genleri ve hücre popülasyonlarını daha fazla incelemek için genomik mühendislik teknolojileri kullanılarak kolayca manipüle edilebilir. Son on yılda, bir sandviç LH enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanılarak farelerde LH konsantrasyonlarının analizinde büyük bir ilerleme, LH’nin bir dakika kanda tespit edilmesine izin vermiştir10. Sık kuyruk ucu kan örnekleme tekniğinin geliştirilmesi, farelerde LH darbelerinin frekansını ve genliğini tespit etmek için gerekli sık örneklemeyi mümkün kılmıştır10,11. Bununla birlikte, kuyruk ucu kan örneklemesi, bilinçli uyanık hayvanlarda kullanımı ile sınırlıdır; Farelerin işleme uyum sağlaması ve örnekleme sırasında belirlenmiş bir araştırmacının varlığına uyum sağlaması için uzun bir eğitim süresi gerektirir. Başarısı çevresel stres faktörlerine karşı oldukça hassastır ve yüksek düzeyde kaygı gösteren fare suşlarında kullanım için uygun olmayabilir. İntra-atriyal kanülasyon, serbestçe hareket eden bilinçli farelerde sık kan örneklemesi için de kullanılmıştır12. Bununla birlikte, bu kurulum hala tekrarlanan manuel kan örneklemesi gerektirir ve hayvanların hareket alanını kısıtlarken, atriyal kanülasyon kalp fonksiyonunda dinamik değişikliklere yol açabilir. Bu nedenle, bilinçli, serbestçe hareket eden ve rahatsız edilmemiş farelerde stressiz koşullar altında, önceden eğitime veya insan kullanımına veya varlığına ihtiyaç duymadan kan toplama için bir yöntem oluşturulması arzu edilir.
Otomatik kan veya diyalizat örneklemesi, dizginlenmemiş kemirgenlerde farklı hormon seviyelerini (örneğin, melatonin13,14) ve bunların pulsatil sekresyonunu (örneğin, büyüme hormonu)15 ölçmek için daha önce kullanılmıştır. Burada, bilinçli ve kontrolsüz hayvanlarda otomatik uzun süreli sık kan örneklemesi için bir protokol sunuyoruz ve kemogenetik teknolojileri kullanarak belirli nöronal popülasyonların zamanında uzaktan aktivasyonu ile birleşiyor: tasarımcı ilaçlar (DREADD’ler) tarafından özel olarak aktive edilen tasarımcı reseptörler. Adeno-ilişkili bir virüs (AAV) vektörünün stereotaksik iletimini ve otomatik intravenöz (IV) klozapin-N-oksit (CNO) iletimi ile uzaktan aktivasyonu açıklayacağız16,17. Bu protokol, aynı anda birden fazla hayvanda bazal seviyelerin ve LH pulsatilitesinde indüklenen değişikliklerin sıralı olarak saptanmasına izin verir. Bileşiğin hem kan örneklemesi hem de IV uygulaması, araştırmacının fiziksel varlığını veya önceden fare eğitimi gereksinimini ortadan kaldıran bir bilgisayar programı aracılığıyla zaman kontrollü bir şekilde gerçekleştirilir. Bu yöntem, manuel kan örneklemesinin ana sınırlamalarının üstesinden gelir. Stressiz bir durumda kan örneklemesine ve uzaktan nöronal aktivite kontrolü ile birlikte eşzamanlı IV bileşik dağıtımına izin verir. Otomatik kan örneklemesinin tek başına veya uzaktan nöronal aktivasyon ile birlikte kullanımının temsili sonuçlarını gösteriyoruz ve avantajlarını, sınırlamalarını ve ek kullanımlarını tartışıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolü kullanarak, bir nöronal popülasyonun uyarılmasından sonra bazal LH pulsatilitesini ve LH sekresyonunu gösterebildik. Sistemin en büyük avantajları, kan örneklemesi sırasında insan varlığı veya elleçleme olmaksızın örneklemenin gerçekleştiği stressiz ortamdır. Ek olarak, deney sırasında önceden zahmetli bir hayvan eğitimi ve insan varlığına veya kullanımına adaptasyon gerekli değildi. Manuel kan örneklemesi kullanan önceki deneyler, stres faktörlerini en aza indirmek için büyük miktarda zaman ve çaba gerektiriyordu 7,31,32. Bununla birlikte, kuyruğu tek başına kesmek bir stres kaynağıdır33. Kesintilerin öngörülemez olduğu ortak hayvan tesislerinde stressiz bir ortam ve eğitim paradigması uygulamak da bir kısıtlama olabilir. Bazı laboratuvarlarda, hayvanların genellikle kan örneklemesi için alternatif prosedür odalarına taşınması gerekir. Bu sınırlamalar, LH seviyelerindeki ince değişikliklerin tespiti için manuel yöntemi uygunsuz hale getirebilir ve bu nedenle, bu durumlarda uygulamalı bir yaklaşım yardımcı olabilir. Otomatik örnekleme, farelerin yeni ortama alışmaları için birkaç gün önceden yerleştirildiği sessiz bir odaya yerleştirilir. Bu protokolle ilgili önceki deneyimimiz, farelerde kortikosteron ve pulsatil büyüme hormonu sekresyon paternlerinin hassas bir şekilde tespit edilmesini sağladı ve otomatik örnekleme sırasında yüksek kortikosteron seviyeleri göstermedi15. Mevcut deneylerde, tüm hayvanlar, ~ 24 saat sonra örnekleme odasında yuva kurmayı ve parlak saç rengini gösteren örnekleme sistemine iyi adapte olmuşlardır, bu da stres eksikliğini ve genel sağlık durumunu gösterir (Şekil 1).
Olumsuz sonuçlara yol açan ana zorluk, muhtemelen AAV’nin gerekli nöronal popülasyona uygun olmayan şekilde hedeflenmesidir. Stereotaksik enjeksiyonlarda hassasiyet esastır ve koordinatları ve enjeksiyon hacimlerini doğrulamak için önceden eğitim yapılmalıdır. Eğitim, iyileşmeyen cerrahide istenen yere az miktarda %0.5-1 Evans Blue enjekte edilerek ve daha sonra bir fare beyin matrisi (örneğin, Ted Pella) kullanılarak yeni disseke edilmiş beynin bir dilimini alarak enjeksiyonun yerini ve boyutunu kontrol ederek bir stereoskop kullanarak yapılabilir.
Otomatik kan örnekleme sisteminden toplanan kan ve plazmanın heparinize salin içinde seyreltileceğini de hesaba katmak önemlidir (örneğin, sonuçlarımızda 50 μL salin içinde 20 μL kan)20 ve seyreltme oranının seçilen analitik yöntemin duyarlılığına göre ayarlanması gerekebilir. BSA-PBS (Ultra Hassas LH ELISA için önerildiği gibi)10 veya salin ile seyreltilmiş tam kandaki LH seviyelerini test ettik ve LH değerlerinde hiçbir fark bulamadık. Ara, seyrelticide kullanılamaz, çünkü bu, numune sıvılarını20 değiştirerek numuneleri çıkarmak için kan sistemine dolaşacaktır. Deneyimlerimize göre, 1:10’dan daha düşük dilüsyonlar iyi LH sonuçları verdi, ancak LH seviyelerini 1:3.5’e kıyasla biraz hafife aldı. Bu, gerekirse toplanan kan miktarını azaltmak için seyreltmenin daha da ayarlanabileceğini gösterir.
Otomatik bileşik dağıtımına bir alternatif, venöz kateter yoluyla manuel enjeksiyonlar yapmaktır. Bu durumda, araştırmacı enjeksiyonu yapmak için odada kısa bir süre bulunur. Bununla birlikte, hayvanlarla veya barınaklarıyla ve çevreleriyle doğrudan temas yoktur ve intraperitoneal veya subkutan enjeksiyonların aksine, tüm prosedür genellikle hayvan tarafından fark edilmez. Manuel enjeksiyonun avantajları, bileşik seyreltmenin önceden ayarlanmasının gerekmemesidir, bu da daha büyük hacimlerde kullanılamayacak kadar pahalı olan veya zamanla bozulmaya duyarlı bileşikler için kritik olabilir; Çalışma hacmi, infüzyon hattının ve kateterin daha fazla bileşik çözelti ile önceden doldurulması gereken otomatik dağıtımdan daha küçük olduğundan.
Otomatik kan örneklemesi, örneğin uyku sırasında LH varyasyonlarını incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar. Örnekleme sırasında yuvalarında uyuyan hayvanları düzenli olarak gözlemledik. Nöral aktivite ve LH paterni34 arasındaki ilişkinin daha ayrıntılı bir analizini oluşturmak için bu örneklemeyi EEG kayıtlarıyla ilişkilendirmek mümkündür. Burada gösterildiği gibi, otomatik kan örneklemesini kullanma olasılıkları çoktur: bazal LH örneklemesinden LH yanıtının endojen veya eksojen bileşiklere test edilmesine veya nöronal popülasyonların aktivasyonuna veya baskılanmasına kadar. Nöronal manipülasyonlar, kemogenetik veya optogenetik ile akut olarak veya transgenik fare modelleri ve apoptotik veya nöronal susturma araçları kullanılarak kalıcı olarak uygulanabilir. Otomatik kan örneklemesi ayrıca yüksek pulsatil salgı modellerine sahip diğer hormonların ölçülmesine de izin verir (örneğin, büyüme hormonu15). Dişi farelerde, östrus döngüsünün belirli bir aşaması gerekiyorsa, vajinal yaymalar, infüzyon ve örnekleme hatlarını bozmadanprotokol 26’ya başlamadan saatler önce dikkatlice toplanabilir. Hayvanlar örnekleme sistemine 7-10 gün boyunca bağlanabilir ve zamanla artan atardamar hattının pıhtılaşma riski vardır.
Bununla birlikte, bu teknik, tek barınaklı hayvanlarda kullanımla sınırlıdır ve bu nedenle sosyal etkileşimleri incelemek için uygun olmayabilir. Aynı zamanda invazivdir ve teknik olarak zorlu cerrahi gerektirir, bu nedenle yavru hayvanlarla veya belirli hastalık modelleriyle uygulanması mümkün olmayabilir. Son olarak, sistemi satın alma maliyeti tek bir araştırma laboratuvarı için çok yüksek olabileceğinden, söz konusu deney protokolünü hizmet olarak sağlayan bir çekirdek laboratuvarda kurulması tavsiye edilir.
Sonuç olarak, bu protokol, otomatik kan örneklemesi ile birlikte AAV’nin stereotaksik uygulamasının nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Bu teknikle elde edilen hassas uzamsal ve zamansal kontrol, farklı modellere, ölçüm protokollerine ve hormonlara uygulama esnekliği ile birlikte, onu kemirgenlerde hormonal regülasyonun incelenmesi için güçlü bir yöntem haline getirir. En önemlisi, yöntem, enjeksiyon ve/veya numune alma sırasında insan varlığını ve elleçlemeyi ve önceki hayvan eğitimini ortadan kaldırarak stressiz bir ortam sağlar. Bu avantajlar, çoğullama olasılığı ile birlikte, bu yöntemi bilinçli, serbestçe hareket eden ve rahatsız edilmemiş farelerde hormonal değişikliklerin sinirsel kontrolünü incelemek için benzersiz bir araç haline getirir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Farklı kan seyreltme yöntemlerinin test edilmesindeki yardımları için Dr. Daniel Haisenleder’e teşekkür ederiz. Serum hormon tahlilleri, Eunice Kennedy Shriver NICHD Grant R24 HD102061 tarafından desteklenen Virginia Üniversitesi Üreme Ligand Testi ve Analiz Çekirdeği Araştırma Merkezi’nde gerçekleştirildi. Michigan Fare Metabolik Fenotipleme Merkezi-Live, NIH Center Grant U2C DK135066 tarafından desteklenmektedir. JF ve NQ, DK020572 (MDRC) ve DK089503 (MNORC) hibeleri tarafından desteklenmektedir. CFE ve CSM, NICHD hibe R21 HD109485 ve R01 HD096324 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Not necessarily this virus but this was the one used for representative results |
| Alcohol | Disinfection | ||
| Anesthesia Induction box | Vetequip | ||
| Anesthesia induction machine | Kent Scientific Equipment | SomnoSuite | |
| Anesthesia masks for mice | Kent Scientific Equipment | SOMNO-0801 | |
| Autoclip applier 9 mm | Clay Adams | 427630 | |
| Autoclip remover 9 mm | Clay Adams | 427637 | |
| Autoclips 9 mm | Clay Adams | 427631 | |
| BASi Culex Controller | Culex | SN: 2151, 2152, 2156, 2158 | 4 stations |
| BASi Honey Comb Fraction Collector | Honey Comb | SN: 2105, 2106, 2107, 2108 | 4 stations |
| BASi Ratrun Rotation Control | RATURN 2 | SN: 5680, 5681, 5682, 5683 | 4 stations |
| C57BL/6J mice | JAX # 000664 | ||
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl | Analgesic |
| Clippers | Braun | ||
| Clozapine-N-oxide | ENZO | BLM-NS105-0005 | |
| Cotton tipped applicators | |||
| CULEX Automated In Vivo Sampling System | BASi | DS000627 | with CX-4000S Replacement Tubing Sets |
| Curved forceps serrated | FST | 11151-10 | |
| Drill | Dremel | 61100 | |
| Empis control Module | EMPIS CM | SN: 174 | |
| Empis Programmable Infusion System | EMPIS | SN: 2125 , 2126, 2127, 2128 | With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations |
| Envigo 2016 diet | low-phytoestrogen diet | ||
| Eye ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment | Petrolatum Ophtalmic oinment |
| Glass pipettes | World Precision Instruments | MIB100-6 | |
| Hemostats | Roboz Surgical | RS-7101 | |
| Iodine | Betadine Surgical scrub | ||
| Isoflurane | VetOne | Fluriso | Anesthetic |
| Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Surgivet or Kent Scientific Corp | SS-01 | Anesthesia Machine |
| Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice | JAX # 023436 and #024109 | ||
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals | 048-56 | |
| Micro-renathane tubing | Braintree Scientific | MRE025 | Surgical catheterization |
| Micro-Scissors | Roboz Surgical | RS-5606 | |
| Needle Holder | Roboz Surgical | RS-7842 | |
| Picoliter injector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P30 | |
| Rodent Warmer X2 | Stoelting | 53850 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 | |
| Scissors | Roboz Surgical | RS-6808 | |
| Silicon tubing | Liveo Laboratory Tubing | NO.508-001 | 0.012 in I.D x 0.025 in O.D. |
| Stereotaxic table | RWD | E06208 | |
| Sterile 0.9% saline | Baxter | 2F7124 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical blades | SKLAR | 06-3011 | |
| Surgical stereoscope | Zeiss | f-160 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4972 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-5058 | |
| Antibodies | |||
| Anti-cFos | Millipore | ABE457 | Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318 |
| Anti-GFP | Aves Labs | GFP-1010 | Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313 |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 711-065-152 | Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593 |
| Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21209 | Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795 |
| Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096 |
| mCherry monoclonal (16D7) | Thermo Fisher Scientific | M11217 | Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611 |
References
- Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice. Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).
- Coquelin, A., Desjardins, C. Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).
- Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).
- Schuiling, G., Gnodde, H. Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats. Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).
- Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice. Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).
- Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. Impact of circadian disruption on female mice reproductive function. Endocrinology. 161 (4), (2020).
- Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).
- Moenter, S. M., Evans, N. P. Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood. Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).
- Maeda, K. I., et al. The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
- Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice. Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).
- Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., Pévet, P., Buijs, R. M. Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night. European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).
- Herwig, A., Pévet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities. Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).
- Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice. Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).
- Krashes, M. J., et al. reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition. National Research Council. , (2011).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).
- Peters, S., et al. Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling. Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).
- Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity. Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice. Endocrinology. 163 (9), (2022).
- Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol. Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).
- Kumar, D., et al. Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice. Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-8 (2009).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Wang, L., et al. Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction. eLife. 8, 43999 (2019).
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).
- Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice. eLife. 10, e68205 (2021).
- Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice. eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).
- Talbi, R., et al. Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice. Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).
- Tuli, J., Smith, J., Morton, D. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).
- Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D. Sleep and puberty. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 17, 1-7 (2021).
