Her presenterer vi en detaljert protokoll for å visualisere mikrotubuli-nettverkene i nevromuskulære veikryss og muskelceller. Kombinert med de kraftige genetiske verktøyene til Drosophila melanogaster, letter denne protokollen i stor grad genetisk screening og mikrotubuli-dynamikkanalyse for rollen som mikrotubulinettverksregulerende proteiner i nervesystemet.
Mikrotubulinettverket er en viktig komponent i nervesystemet. Mutasjoner i mange mikrotubuli regulatoriske proteiner er assosiert med nevrodevelopmental lidelser og nevrologiske sykdommer, slik som mikrotubuli-assosiert protein Tau til neurodegenerative sykdommer, mikrotubuli kutte protein Spastin og Katanin 60 forårsake arvelig spastisk paraplegi og nevrodevelopmental abnormiteter, henholdsvis. Deteksjon av mikrotubulære nettverk i nevroner er fordelaktig for å belyse patogenesen av nevrologiske lidelser. Den lille størrelsen på nevroner og det tette arrangementet av aksonale mikrotubulibunter gjør imidlertid visualisering av mikrotubuli-nettverkene utfordrende. I denne studien beskriver vi en metode for disseksjon av larvens nevromuskulære overgang og muskelceller, samt immunfarging av α-tubulin og mikrotubuli-assosiert protein Futsch for å visualisere mikrotubulinettverk i Drosophila melanogaster. Det nevromuskulære veikrysset tillater oss å observere både pre- og postsynaptiske mikrotubuli, og den store størrelsen på muskelceller i Drosophila-larven muliggjør klar visualisering av mikrotubulinettverket. Her, ved å mutere og overuttrykke Katanin 60 i Drosophila melanogaster, og deretter undersøke mikrotubuli-nettverkene i det nevromuskulære veikrysset og muskelcellene, avslører vi nøyaktig den regulatoriske rollen til Katanin 60 i nevroutvikling. Derfor, kombinert med de kraftige genetiske verktøyene til Drosophila melanogaster, letter denne protokollen i stor grad genetisk screening og mikrotubuli dynamikkanalyse for rollen som mikrotubuli nettverksregulerende proteiner i nervesystemet.
Mikrotubuli (MT), som en av de strukturelle komponentene i cytoskelettet, spiller en viktig rolle i ulike biologiske prosesser, inkludert celledeling, cellevekst og motilitet, intracellulær transport og vedlikehold av celleform. Mikrotubuli dynamikk og funksjon moduleres av interaksjoner med andre proteiner, slik som MAP1, MAP2, Tau, Katanin og Kinesin 1,2,3,4,5.
I nevroner er mikrotubuli avgjørende for utvikling og vedlikehold av aksoner og dendritter. Abnormaliteter i mikrotubuli fører til dysfunksjon og til og med død av nevroner. For eksempel, i hjernen til Alzheimers pasienter, reduserer Tau-protein hyperfosforylering stabiliteten til mikrotubulinettverket, noe som forårsaker nevrologiske uregelmessigheter6. Dermed vil undersøkelse av mikrotubulinettverk bidra til en forståelse av nevroutvikling og patogenesen av nevrologiske sykdommer.
Det nevromuskulære veikrysset (NMJ) er den perifere synapsen dannet mellom en motorneuronaksonterminal og en muskelfiber, som er et utmerket og kraftig modellsystem for å studere synaptisk struktur og funksjoner7. Futsch er et protein i Drosophila som er homologt med det mikrotubulibindende proteinet MAP1B som finnes hos pattedyr8. Det uttrykkes bare i nevroner og spiller en rolle i utviklingen av NMJs synaptiske knapper 8,9. I villtype visualiseres filamentøse bunter som går langs midten av NMJ-prosesser ved immunfarging med anti-Futsch. Når den når NMJs ende, har denne bunten evnen til enten å danne en sløyfe bestående av mikrotubuli eller å miste sin trådformede struktur, noe som resulterer i et diffust og punktert utseende10. Mikrotubuli sløyfer er assosiert med pauset vekstkjegler, noe som antyder at mikrotubuli-matrisen er stabil11. Derfor kan vi indirekte bestemme den stabile mikrotubuliutviklingen i NMJ ved Futsch-farging. Den store størrelsen på muskelceller i Drosophila larven muliggjør klar visualisering av mikrotubulinettverket. Faktorene som påvirker stabiliteten til mikrotubuli-nettverket kan bli funnet ved å analysere tettheten og formen til mikrotubuli. Samtidig kan mikrotubuli nettverksstatus for muskelceller kryssverifiseres med resultatet av NMJ for å oppnå mer omfattende konklusjoner.
Mange protokoller har blitt brukt for å undersøke nettverket og dynamikken til mikrotubuli. Imidlertid har disse undersøkelsene ofte fokusert på in vitro-studier 12,13,14,15,16. Alternativt har noen in vivo-eksperimenter brukt elektronmikroskopi for å oppdage cytoskjelettet17. I henhold til den spesifikke bindingen av fluorescerende merkede antistoffer eller kjemiske fargestoffer til proteiner eller DNA, tillater metodene som presenteres her deteksjon av mikrotubulinettverk i NMJ på nivået av individuelle nevroner in vivo, med resultater bekreftet av observasjoner i muskelceller. Denne protokollen er enkel, stabil og repeterbar når den kombineres med de kraftige genetiske verktøyene som er tilgjengelige i Drosophila melanogaster, noe som muliggjør et mangfoldig utvalg av fenotypiske undersøkelser og genetiske screeninger for rollen som mikrotubulinettverksregulatoriske proteiner i nervesystemet in vivo.
Her beskrives en protokoll for disseksjon og immunfarging av Drosophila larve, nevromuskulære veikryss og muskelceller. Det er flere viktige punkter å vurdere. For det første er det viktig å unngå skade på de observerte musklene under disseksjonsprosessen. Det kan være verdt å feste fileten før du fjerner indre organer for å hindre direkte kontakt mellom tangen og musklene. For å unngå muskelskade eller separasjon fra larveepidermis, er det viktig å sikre at shakerens hastighet ikke overstiger 15 o …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Ying Xiong for diskusjoner og kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet støttes av et tilskudd fra National Science Foundation of China (NSFC) til CM (31500839).
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
Tweezers | dumont | 500342 |