Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.
Abstract
Het netwerk van microtubuli is een essentieel onderdeel van het zenuwstelsel. Mutaties in veel regulerende eiwitten van microtubuli worden geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen en neurologische aandoeningen, zoals microtubuli-geassocieerd eiwit Tau tot neurodegeneratieve ziekten, microtubuli-afsnijdend eiwit Spastin en Katanin 60 veroorzaken respectievelijk erfelijke spastische dwarslaesie en neurologische ontwikkelingsafwijkingen. Detectie van microtubuli-netwerken in neuronen is voordelig voor het ophelderen van de pathogenese van neurologische aandoeningen. De kleine omvang van neuronen en de dichte rangschikking van axonale microtubulibundels maken het visualiseren van de microtubuli-netwerken echter een uitdaging. In deze studie beschrijven we een methode voor dissectie van de larvale neuromusculaire junctie en spiercellen, evenals immunokleuring van α-tubuline en microtubuli-geassocieerd eiwit Futsch om microtubuli-netwerken in Drosophila melanogaster te visualiseren. De neuromusculaire junctie stelt ons in staat om zowel pre- als postsynaptische microtubuli te observeren, en de grote omvang van spiercellen in Drosophila-larven zorgt voor een duidelijke visualisatie van het microtubuli-netwerk. Hier, door Katanin 60 te muteren en tot overexpressie te brengen in Drosophila melanogaster, en vervolgens de microtubuli-netwerken in de neuromusculaire junctie en spiercellen te onderzoeken, onthullen we nauwkeurig de regulerende rol van Katanin 60 in de neurologische ontwikkeling. Daarom, in combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de dynamiek van microtubuli aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.
Introduction
Microtubuli (MT’s), als een van de structurele componenten van het cytoskelet, spelen een belangrijke rol in diverse biologische processen, waaronder celdeling, celgroei en -motiliteit, intracellulair transport en het behoud van de celvorm. De dynamiek en functie van microtubuli worden gemoduleerd door interacties met andere eiwitten, zoals MAP1, MAP2, Tau, Katanin en Kinesin 1,2,3,4,5.
In neuronen zijn microtubuli essentieel voor de ontwikkeling en het onderhoud van axonen en dendrieten. Afwijkingen in microtubuli leiden tot disfunctie en zelfs de dood van neuronen. In de hersenen van Alzheimerpatiënten vermindert hyperfosforylering van het Tau-eiwit bijvoorbeeld de stabiliteit van het microtubuli-netwerk, waardoor neurologische onregelmatigheden ontstaan. Het onderzoeken van microtubuli-netwerken zal dus bijdragen aan een beter begrip van de neurologische ontwikkeling en de pathogenese van neurologische aandoeningen.
De neuromusculaire junctie (NMJ) is de perifere synaps die wordt gevormd tussen een axonterminal van een motorneuron en een spiervezel, wat een uitstekend en krachtig modelsysteem is voor het bestuderen van synaptische structuur en functies7. Futsch is een eiwit in Drosophila dat homoloog is aan het microtubuli-bindende eiwit MAP1B dat wordt aangetroffen bij zoogdieren8. Het komt alleen tot expressie in neuronen en speelt een rol bij de ontwikkeling van de synaptische knoppen van het NMJ 8,9. In wild-type worden filamenteuze bundels die langs het centrum van NMJ-processen lopen, gevisualiseerd door immunokleuring met anti-Futsch. Bij het bereiken van het einde van NMJ heeft deze bundel het vermogen om ofwel een lus te vormen die bestaat uit microtubuli of om zijn filamenteuze structuur te verliezen, wat resulteert in een diffuus en puntvormig uiterlijk10. Microtubuli-lussen worden geassocieerd met gepauzeerde groeikegels, wat suggereert dat de microtubuli-array stabiel is11. Daarom kunnen we indirect de stabiele ontwikkeling van microtubuli in NMJ bepalen door Futsch-kleuring. De grote omvang van spiercellen in de larve van Drosophila zorgt voor een duidelijke visualisatie van het netwerk van microtubuli. De factoren die van invloed zijn op de stabiliteit van het netwerk van microtubuli kunnen worden gevonden door de dichtheid en vorm van microtubuli te analyseren. Tegelijkertijd kan de netwerkstatus van spiercellen in microtubuli worden geverifieerd met het resultaat van NMJ om uitgebreidere conclusies te verkrijgen.
Er zijn veel protocollen gebruikt voor het onderzoeken van het netwerk en de dynamiek van microtubuli. Deze onderzoeken hebben zich echter vaak gericht op in vitro studies 12,13,14,15,16. Als alternatief hebben sommige in vivo experimenten elektronenmicroscopie gebruikt om het cytoskelet te detecteren17. Volgens de specifieke binding van fluorescerend gelabelde antilichamen of chemische kleurstoffen aan eiwitten of DNA, maken de hier gepresenteerde methoden de detectie van microtubuli-netwerken in NMJ op het niveau van individuele neuronen in vivo mogelijk, met resultaten die worden bevestigd door waarnemingen in spiercellen. Dit protocol is eenvoudig, stabiel en herhaalbaar in combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila melanogaster, waardoor een breed scala aan fenotypische onderzoeken en genetische screenings mogelijk is voor de rol van regulerende eiwitten van microtubuli-netwerken in het zenuwstelsel in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een protocol beschreven voor de dissectie en immunokleuring van Drosophila larvale neuromusculaire juncties en spiercellen. Er zijn verschillende essentiële punten om rekening mee te houden. Ten eerste is het voorkomen van letsel aan de waargenomen spieren cruciaal tijdens het dissectieproces. Het kan de moeite waard zijn om de filet te fixeren voordat u inwendige organen verwijdert om direct contact tussen de tang en de spieren te voorkomen. Om spierbeschadiging of scheiding van de larvale epidermis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Ying Xiong voor de discussies en commentaren op het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation of China (NSFC) aan C. M. (31500839).
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
