שימור קריוגני והערכה ביואנרגטית של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי
Summary
תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים יכולים לשמש לניתוח של תפקודים והפרעות חיסוניות, מחלות מטבוליות או תפקודים מיטוכונדריאליים. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית להכנת PBMCs מדם שלם ושימור בהקפאה לאחר מכן. שימור בהקפאה הופך את הזמן והמקום הזה לעצמאיים.
Abstract
התפקודים הפיזיולוגיים של תאים אאוקריוטים מסתמכים על אנרגיה המסופקת בעיקר על ידי מיטוכונדריה. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למחלות מטבוליות ולהזדקנות. זרחן חמצוני משחק תפקיד מכריע, שכן הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס אנרגטי. PBMCs זוהו כמדגם זעיר פולשני למדידת תפקוד המיטוכונדריה והוכחו כמשקפים מצבי מחלה. עם זאת, מדידת התפקוד הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה יכולה להיות מוגבלת על ידי מספר גורמים בדגימות אנושיות. המגבלות הן כמות הדגימות שנלקחו, זמן הדגימה, אשר לעתים קרובות מפוזר על פני מספר ימים, ומיקומים. שימור בהקפאה של הדגימות שנאספו יכול להבטיח איסוף ומדידה עקביים של דגימות. יש להקפיד על כך שהפרמטרים שנמדדו דומים בין תאים משומרים בהקפאה לבין תאים טריים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לבידוד ושימור PBMCs בהקפאה מדגימות דם אנושיות כדי לנתח את התפקוד הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה בתאים אלה. PBMC נשמר בהקפאה על פי הפרוטוקול המתואר כאן מראה רק הבדלים קלים במספר התאים וביכולת הכדאיות, ברמות אדנוזין טריפוספט ובפעילות שרשרת הנשימה שנמדדה בהשוואה לתאים שזה עתה נקטפו. רק 8-24 מ”ל של דם אנושי נדרש עבור ההכנות המתוארות, מה שמאפשר לאסוף דגימות במהלך מחקרים קליניים multicentral ולקבוע bioenergetics שלהם באתר.
Introduction
תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) משמשים ליישומים שונים בתחומים מדעיים רבים, כולל חקר נושאים אימונולוגיים וביו-אנרגטיים, כגון אלה הקשורים לתהליכי הזדקנות או מחלות ניווניות 1,2. PBMCs הם הטרוגניים בהרכבם ומורכבים מלימפוציטים (תאי B, תאי T ותאי NK), מונוציטים ותאים דנדריטיים. התאים מראים לפעמים הבדלים אינדיבידואליים גדולים ווריאציות בתוך נושא, ולכן נדרשים נהלים סטנדרטיים לטיפול בתאים אלה. פרמטרים חשובים כמו כדאיות וטוהר הבידוד הם הדרישות הבסיסיות לטיפול בו ומושפעים גם מגורמים סביבתיים כמו זמן האיסוף, רמת המלטונין, האם הנבדק בצום ועוד 3,4.
בהתבסס על מחקרים על ביו-אנרגטיקה של PBMCs, אנו מתארים כאן שיטה לבידוד, שימור הקפאה וטיפוח של PBMCs המתאימה גם לשיטות אחרות. בעוד שביופסיה של שריר נחשבת לתקן הזהב למטבוליזם של אנרגיה מיטוכונדריאלית5, בדיקת תאי הדם היא הליך מהיר וזעיר פולשני. בנוסף לכך, יותר ויותר מחקרים מצביעים על כך שהשינויים בתפקוד המיטוכונדריה בהזדקנות ובאלצהיימר מתרחשים לא רק במוח אלא גם בפריפריה 6,7,8,9,10. השיטה מאפשרת גם חקירות של מצבים ומחלות אחרות, כולל סוכרת והשמנת יתר 11,12,13. ניתן לנתח דפוסי ביטוי גנים בחולי טרשת נפוצה, או תפקוד מערכת החיסון והשפעותיו עליה באופן כללי 14,15,16.
PBMCs בדרך כלל מסתמכים על זרחן חמצוני (OXPHOS) כדי לייצר אדנוזין טריפוספט (ATP)17,18. לכן, PBMCs מכסים מגוון רחב של יישומים כפונדקאיות. בדוחות קודמים, חילוף החומרים האנרגטי של PBMCs שימש לטיפול בתפקוד לקוי של איברים, כגון אי ספיקת לב מוקדמת19, הלם ספטי20 או הבדלים הקשורים למין4 בתפקוד המיטוכונדריה. לשיטה כללית לבידוד הקפאה וטיפוח של PBMCs יהיו יתרונות בהשוואת התוצאות המתקבלות במכונים שונים. קיימת שונות רבה בפרוטוקולים עבור כל שלב21,22, מטרת שיטה זו היא לספק קו מנחה למדידות ביו-אנרגטיות במרכזיות.
במאמר זה נתאר שיטה למדידת פרמטרים ביו-אנרגטיים במרכזיות. אנו מסבירים את השיטות לבידוד, שימור ומדידה של ביו-אנרגטיקה של PBMCs מדם אנושי. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פרמטרים ביו-אנרגטיים בחולים ולהעריך אותם בהקשר קליני. כדי ליישם מדידות אלה, החוקרים זקוקים לגישה לאוכלוסיית חולים שממנה ניתן לקבל דגימות דם טריות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק אמצעי לבידוד ושימור בהקפאה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדם אנושי באופן המתאים לאנליזות ביו-אנרגטיות. השיטה המתוארת מציעה אפשרות לבודד PBMCs בעדינות ובכמויות גדולות, עם כדאיות גבוהה ותאים מספיקים למדידות ביו-אנרגטיות. יש לו את החיסרון כי אפילו עם הפרעות מינימליות, ביד?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לצוות הקליני של בית החולים האוניברסיטאי גיסן-מרבורג על איסוף הדם. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת יוסטוס ליביג.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologie. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
