개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.
개의 장은 해부학, 미생물학, 생리학적으로 인간과 유사하며, 개는 자연적으로 인간과 유사한 자발적 장 질환을 앓게 됩니다. 장 상피의 정점 표면에 접근하는 데 있어 3차원(3D) 오가노이드의 고유한 한계를 극복하기 위해 오가노이드에서 파생된 세포를 사용하여 접근 가능한 내강 표면을 노출하는 2차원(2D) 단층 배양이 생성되었습니다. 이러한 오가노이드와 오가노이드 유래 단층 배양을 미세유체 Gut-on-a-Chip 시스템에 통합함으로써 기술이 더욱 발전하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 동적 in vitro 장 모델을 개발할 수 있게 되었습니다.
이 연구에서는 염증성 장 질환(IBD)에 걸린 개에서 얻은 1차 장 조직 샘플을 사용하여 개 장 상피의 3D 형태 형성을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 3D 장 오가노이드에서 파생된 세포를 사용하여 2D 단층 배양 및 장-온-a-칩 시스템을 생성하고 유지하기 위한 프로토콜에 대해서도 설명합니다. 이 연구에서 제시된 프로토콜은 반려견을 위해 특별히 설계된 미세유체 Gut-on-a-Chip 시스템을 구축하기 위한 기본 프레임워크 역할을 합니다. 이 혁신적인 접근 방식의 토대를 마련함으로써 우리는 One Health Initiative의 원칙에 따라 생물 의학 및 중개 연구에서 이러한 기술의 적용을 확대하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 활용함으로써 우리는 개와 인간 모두의 장 생리학을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 동적 체외 모델을 개발할 수 있습니다. 이는 두 종 모두에서 장 질환에 대한 보다 효과적인 치료법 개발에 도움이 될 수 있기 때문에 생물 의학 및 제약 응용 분야에 중요한 영향을 미칩니다.
장 상피 형태 형성은 주로 실험 동물 모델을 통해 연구되어 왔는데, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 인간 발달 과정을 정확하게 나타내지 못합니다1. 또한, 기존의 정적 2D 세포 배양 모델은 3D 상피 구조의 복잡한 공간 구성을 모방할 수 있는 능력이 부족하다2. 그 결과, 장 상피 구조에 대한 이해를 높이기 위해 인간 관련 동물 모델의 장 상피 세포를 사용하여 in vitro 3D 형태 형성을 유도하는 프로토콜이 필요합니다.
반려견은 가축화 과정에서 환경과 식단을 공유하기 때문에 인간과 매우 유사한 장내 해부학적 구조와 마이크로바이옴 구성을 발달시켰다3. 이러한 유사성 외에도 인간과 개는 장 건강에 기인하는 것으로 생각되는 다양한 만성 질환을 공유합니다. 개는 인간과 마찬가지로 비만, 인지 기능 장애, 당뇨병, 염증성 장 질환(IBD) 및 결장직장 선암과 같은 만성 질환이 자발적으로 발생할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10. 이전의 Gut-on-a-Chip 연구 2,11,12,13,14에서 인간과 쥐 상피 세포의 개발 및 사용에도 불구하고 개 장 상피는 지금까지 활용되지 않았습니다. 3D 상피 형태 형성이 있는 동적 배양 시스템에서 개의 장 오가노이드 상피를 활용하는 당사의 새로운 접근 방식은 개와 인간 의학 모두에 중요한 영향을 미칩니다.
최근 장내 오가노이드 배양의 발전으로 개의 장 오가노이드 배양이 확립되었다15. 이 배양 시스템은 정의된 모르포겐 컨디셔닝 하에서 장 줄기세포를 배양하는 것을 포함하며, 그 결과 성체 줄기 세포로부터 유래된 자가 재생 특성을 갖는 3D 모델이 생성된다16. 그러나, 수송 분석 또는 숙주-마이크로바이옴 공동 배양을 수행하는 것은 장 내강(intestal lumen)의 밀폐된 특성 때문에 이 3D 모델에 어려움을 야기한다17. 이를 해결하기 위해 연구원들은 장 오가노이드에서 파생된 2D 단층을 생성하여 발광 표면18,19의 노출을 허용했습니다. 그러나 3D 오가노이드와 2D 단층 모두 정적인 조건에서 유지되기 때문에 장내 미세환경의 생체 내 생체 역학을 정확하게 반영하지 못합니다. 환자 유래 반려견 오가노이드 기술과 체외 3D 형태 형성을 결합하면 만성 다인자 질환에 대한 중개 연구의 기회를 얻을 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 연구자들은 인간과 개 모두에게 도움이 되는 보다 효과적인 치료법을 개발하고 인간, 동물 및 환경 건강의 상호 연결성을 인식하는 협력 접근 방식인 One Health Initiative에 따라 중개 연구를 더욱 발전시킬 수 있습니다. 복잡한 건강 문제를 해결하고 모두를 위한 최적의 건강 결과를 달성하기 위해 학제 간 협력을 촉진합니다. 이 이니셔티브는 인간, 동물 및 생태계 간의 상호 의존성을 이해함으로써 신종 전염병, 환경 악화 및 기타 공통된 건강 문제로 인한 위험을 완화하는 것을 목표로 합니다20,21,22.
이 프로토콜은 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 다공성 멤브레인이 있는 Gut-on-a-Chip 마이크로디바이스에서 환자 오가노이드에서 얻은 개의 장 상피 세포를 배양하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 개의 장 오가노이드와 이 Gut-on-a-Chip 기술을 통합하여 3D 상피 형태 형성을 확립함으로써 장이 세포 조직과 줄기 세포 틈새를 어떻게 발달하고 유지하는지 연구할 수 있습니다. 이 플랫폼은 마이크로바이옴 군집이 장 건강에 미치는 영향을 조사하고 이러한 군집이 장 병태생리학에 기여하는 미생물 대사 산물을 생성하는 방법을 이해할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다14,23. 이러한 발전은 이제 개의 장 샘플로 확장되어 연구자들에게 장내 마이크로바이옴과 숙주 생리학 사이의 복잡한 관계를 탐구할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 이를 통해 장 병태생리학의 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻고 개와 인간의 건강뿐만 아니라 다양한 질병 상태에서 미생물 대사 산물의 잠재적 역할을 이해할 수 있는 길이 열립니다. 개 Gut-on-a-Chip에 사용되는 프로토콜은 재현성이 뛰어나 이 접근법을 통해 개와 사람 모두에서 숙주-마이크로바이옴 상호 작용, 병원체 감염 및 프로바이오틱스 기반 치료 효과를 조사할 수 있으므로 비교 의학에 적합한 실험 모델입니다.
이 연구는 개의 장 오가노이드와 개의 IBD Gut-on-a-Chip 모델 개발의 호환성을 선구적으로 입증한 것입니다. 장내 오가노이드와 오가노이드 유래 단층 배양을 미세유체 시스템(즉, Gut-on-a-Chip 시스템)에 통합함으로써 기술이 더욱 발전하여 생리학적 역학을 밀접하게 모방하고 생물학적 조건을 더 잘 대표하는 체외 장 모델을 만들 수 있게 되었습니다. 특히, 인간에게 IBD 유래 오가노이드를 사용한 Gut-on-a-Chip 배양에 대한 보고가 거의 없기 때문에, 개 IBD 유래 Gut-on-a-Chip을 사용한 이번 연구는 인간 IBD 연구에 대한 선도적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Gut-on-a-Chip에서 개의 장 상피 3D 형태 형성을 성공적으로 개발하려면 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 첫째, PDMS 미세유체 채널의 소수성 표면은 ECM 접착 및 후속 셀 부착을 방해할 수 있으므로 ECM 코팅 및 셀 파종 전에 PDMS의 표면 활성화가 필요합니다(프로토콜 섹션 1 참조). 안정적인 단층 배양을 달성하려면 세포 부착 후 과도한 미부착 세포를 제거하는 것이 중요합니다(프로토콜 단계 4.6-4.7). 또한 일정한 배지 흐름 및 연동과 같은 진공 운동과 같은 동적 자극은 장 상피의 3D 형태 형성에 필요합니다(프로토콜 단계 5.2). Gut-on-a-Chip 배양의 모든 단계에서 마이크로채널의 기포를 방지하기 위해서는 신중한 취급이 필수적입니다.
Gut-on-a-Chip에 세포 파종이 불량한 경우 세포 수가 적거나 세포 부착이 불량하기 때문일 수 있습니다. 낮은 세포 수 문제를 해결하려면 Matrigel에서 성장을 관찰하여 준비된 장내 오가노이드의 상태를 검사하는 것이 중요합니다. 세포 해리 후 Trypan blue 염색으로 세포 생존율을 평가하여 세포의 20% 이상이 죽지 않도록 할 수 있습니다. 생존 가능한 세포 수가 충분하지 않은 경우 오가노이드 배지 조건을 최적화할 수 있습니다. 또 다른 가능성은 불완전한 오가노이드 해리로, 이로 인해 70μm보다 큰 세포 덩어리가 과도하게 발생하여 필터에 갇히게 됩니다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 옵션은 세포 해리 중 피펫팅 기간을 연장하는 것입니다. 또는 15mL 코니컬 튜브를 트립신 유사 프로테아제로 치료하는 동안 매분마다 부드럽게 교반할 수 있습니다. Gut-on-a-Chip에 대한 세포 부착 불량은 부적절한 ECM 코팅으로 인한 것일 수 있습니다. 코팅 과정에서 기포의 존재 여부를 주의 깊게 확인하고 필요에 따라 코팅 용액을 부드럽게 추가하여 기포 형성을 방지하는 것이 좋습니다. 세포가 과밀화되고 부착되지 않은 세포를 씻어내지 못하면 초기 단층이 불충분해질 수 있습니다. 이 경우 주사기 플런저를 밀 때 약간의 펄스가 가해질 수 있습니다. 이러한 문제 해결 단계는 Gut-on-a-Chip 배양 프로세스 중에 문제를 식별하고 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 Gut-on-a-Chip 플랫폼을 사용하면 물결 모양의 3D 상피층을 생성할 수 있지만, 장내 미세환경을 완전히 복제하기 위해서는 추가적인 생물학적 복잡성이 필요하다는 것을 알고 있습니다. 상피 세포와 중간엽 세포 간의 상호 작용, 3D 재생을 위한 ECM의 증착, 적절한 줄기 세포 틈새를 형성하는 크립트-융모 특성의 존재를 고려하는 것이 중요합니다. 섬유아세포(fibroblast)와 같은 기질 세포는 ECM 단백질의 생산과 장 형태형성(intestinal morphogenesis)의 조절에 중요한 역할을 한다34,35,36. 이 모델에 중간엽 세포를 포함하면 형태 형성과 세포 부착 효율성을 모두 향상시킬 수 있습니다. 모세혈관과 림프관을 포함하는 내피층은 분자 수송과 면역 세포의 모집을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다37,38. 환자 유래 면역 세포의 포함은 선천성 면역과 적응 면역 사이의 상호 작용을 입증하고 조직 특이적 면역을 확립할 수 있기 때문에 장 질환 모델링에 필수적일 수 있습니다39. Gut-on-a-Chip에서 3D 형태 형성이 완료된 후 오가노이드 배양 배지를 오가노이드 분화 배지로 변형할 수 있습니다. 이는 실험 목표에 따라 추가적인 세포 분화를 유도하는 실행 가능한 접근 방식이 될 수 있습니다.
3D 마이크로아키텍처 를 in situ 이미징하는 것은 긴 작동 거리가 필요하기 때문에 까다로우며, 이는 장거리 대물렌즈로 극복할 수 있습니다. 또한 층별 미세 가공 및 접착 방법은 SEM으로 검사하기 위해 상층에 접근하기 어렵게 만듭니다. 현재 Gut-on-a-Chip 설계의 경우 Gut-on-a-Chip 마이크로 장치당 하나의 주사기 펌프가 필요하며, 이는CO2 인큐베이터 공간을 차지하고 대규모 실험을 방지합니다. 사용자 친화적인 플랫폼과 고처리량 스크리닝을 위해 확장성을 높이기 위해서는 혁신이 필요합니다.
이러한 현재 프로토콜은 체외에서 3D 상피층의 자발적인 개발을 가능하게 하여 기존 3D 오가노이드, 2D 단층 및 정적 마이크로디바이스 배양 시스템의 한계를 뛰어넘습니다. 이러한 역동적인 in vitro 장내 미세환경은 다양한 세포 유형의 공동 배양을 도입하여 제어할 수 있습니다. 이전 연구에서는 장내 마이크로바이옴(14,23) 및 말초 단핵 세포(30)를 공동 배양하는 것을 포함하여 Gut-on-a-Chip 미세환경을 조작하는 방법을 탐구했습니다. 이 재구성 된 미세 환경은 약물 테스트, 기초 기계 연구 및 질병 모델링을 포함하여 수많은 잠재적 응용 분야를 가지고 있습니다. 재구성된 미세환경은 약물 검사(23,40,41) 및 질병 모델링(12,13,14,30)과 같은 광범위한 응용뿐만 아니라 장 형태 형성(42)의 근본적인 기계론적 조사에 상당한 잠재력을 가지고 있다. 대사 산물(43)의 평가를 위한 상층액을 수집하거나, 게놈 검사(2,32)를 위한 세포를 수집하거나, 또는 후속 면역형광 이미징(23,44)을 위해 살아있는 세포 염료 또는 고정을 사용하여 세포를 육안으로 검사함으로써 다양한 분석을 수행할 수 있다.
이 연구는 Gut-on-a-Chip 플랫폼에서 개 장 상피층의 3D 형태 형성을 개발하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 그 결과 3D 상피 구조는 장내 미세환경을 보다 사실적으로 표현할 수 있으며, 이는 다양한 생물의학 연구에 응용할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이 장 구조를 활용함으로써 우리는 더 많은 중개 연구를 수행하고 잠재적으로 유망한 결과를 얻을 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
시민 과학자(환자 기증자)의 사례 모집 및 샘플 수집을 지원해 주신 WSU 소동물 내과 서비스(Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT)와 WSU VTH 임상 연구 코디네이터 Valorie Wiss에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, K01OD030515 및 R21OD031903 to Y.M.A.) 소장실과 일본 과학 진흥 협회 젊은 연구자를 위한 해외 챌린지 프로그램(202280196 to I.N.)의 지원을 받았습니다. 그림 1A와 그림 3A는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Organoid basal medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
Organoids and organoid medium | |||
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
[Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
Reagents | |||
4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
Materials and Equipment | |||
24-well culture plates | Corning | 3524 | |
87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
Software | |||
LAS X imaging software | Leica microsystems |