הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי
Summary
תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.
Abstract
ניוון רשתית הוא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם. מאמצים נרחבים נעשים לפתח תותבות רשתית מתקדמות שיכולות לעקוף את תאי קולטני האור הלקויים ברשתית המנוונת, במטרה לשחזר חלקית את הראייה על ידי גרימת תפיסת ראייה. אפיק חקירה נפוץ אחד כרוך בתכנון וייצור של התקנים מושתלים בעלי מבנה פיזי גמיש, המאכלס מספר גבוה של אלקטרודות. זה מאפשר יצירה יעילה ומדויקת של תפיסות חזותיות. עם זאת, עם כל התקדמות טכנולוגית, מתעורר צורך בשיטת ex vivo אמינה וניתנת לניהול כדי לאמת את הפונקציונליות של המכשיר לפני התקדמות לניסויים in vivo , שבהם גורמים מעבר לביצועי המכשיר נכנסים לפעולה. מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית (GCL) בעקבות גירוי חשמלי. באופן ספציפי, השלבים הבאים מתוארים: (1) תיוג פלואורסצנטי של רשתית החולדה באמצעות מחווני סידן מקודדים גנטית, (2) לכידת האות הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך תוך יישום דפוסים ברורים של גירוי חשמלי, ו-(3) חילוץ וניתוח עקבות הסידן מתאים בודדים בתוך GCL. על ידי ביצוע הליך זה, חוקרים יכולים לבדוק ביעילות פרוטוקולי גירוי חדשים לפני ביצוע ניסויים in vivo .
Introduction
הרשתית מכילה פוטורצפטורים, שהם תאים האחראים על חישת אור. הם לוכדים פוטונים וממירים אותם לדחפים עצביים. דחפים אלה מעובדים בתוך הרשתית ומועברים לקליפת המוח הראייתית, וכתוצאה מכך נוצרת תמונה חזותית1. רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) וניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) הן מחלות ניווניות המאופיינות באובדן פרוגרסיבי של פוטורצפטורים. רטינופתיה זו היא בין הגורמים המובילים לעיוורון ברחבי העולם1, משפיעה על מיליוני אנשים ויש לה השלכות רפואיות, אישיות וסוציו-אקונומיות משמעותיות על חולים, מערכות בריאות והחברה כולה. יתר על כן, עם הזדקנות האוכלוסייה, צפוי כי מקרי AMD יגדל ב -15% עד 20502.
כיום, נעשים מאמצי מחקר רבים כדי לשחזר את הראייה בחולים שנפגעו ממצבים אלה3. גישה מבטיחה אחת היא השימוש בתותבות רשתית, אשר הוכיחו יעילות בשחזור חלקי של ראייה 4,5. מכשירים אלה לוכדים אור מהסצנה החזותית וממירים אותו לפולסים חשמליים. פולסים אלה מועברים באמצעות אלקטרודות בתוך מערך מיקרואלקטרודות (MEA) המושתל בעין, מגרה את תאי העצב ששרדו ועוקף את תפקודם של הפוטורצפטורים שאבדו. תאי גנגליון הרשתית המופעלים (RGCs) מעבירים את הפלט למוח, שם הוא מתפרש כתפיסה חזותית. עם זאת, המגבלות העיקריות של השתלים הנוכחיים טמונות ברזולוציה של ממשק אלקטרודה-רקמה6 וגירוי לא סלקטיבי של סוגי תאים שונים. לכן, כדי לייעל את התכנון של התקנים מושתלים חדשים לשיקום ראייה יעיל יותר, חיוני להבין כיצד ניתן לפתח פרדיגמות גירוי כדי להפעיל באופן סלקטיבי תאים בסמיכות לאלקטרודות.
הדמיית סידן היא טכניקה נפוצה לחקר פעילות עצבית, המציעה מספר יתרונות על פני שיטות לא אופטיות 7,8. ראשית, הוא מספק רזולוציה סלולרית ותת-תאית. שנית, סמני סידן יכולים להתמקד בסוגי תאים ספציפיים. שלישית, היא מאפשרת מעקב ארוך טווח, ורביעית, היא מאפשרת תצפית על אוכלוסיות תאים שלמות תוך הבחנה בין תאים פעילים ללא פעילים. שיטה זו מספקת עדות עקיפה לפעילות תאית ברזולוציה טמפורלית בטווח של מאות אלפיות השנייה. מדדי סידן פלואורסצנטיים המקודדים גנטית, כגון חיישני GCaMP, עוברים שינוי קונפורמציה עם קשירה לסידן, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת9. וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (AAVs) הם אמצעי יעיל להמרת תאי רשתית עם GCaMP10.
פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה המנצלת הדמיית סידן לבדיקת פרוטוקולי גירוי של שתלי רשתית. באופן ספציפי, אנו מתמקדים ברקמת הרשתית של חולדה ex vivo ומספקים הוראות מפורטות שלב אחר שלב, החל מרכישת דגימה ועד ניתוח נתונים. על ידי הצעת מדריך מקיף זה, חוקרים מרקעים שונים יכולים להתחיל ניסויים גירוי חשמלי בביטחון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן משמש לחקר דינמיקת הסידן המתרחשת ברשתית החולדה GCL לאחר גירוי חשמלי המסופק עם MEA. זוהי שיטה אמינה וניתנת לניהול אך דורשת הכשרה מסוימת, במיוחד כדי לתייג באופן אחיד את ה- GCL ביעילות ולהרכיב את הרשתית כראוי כדי להבטיח מגע אופטימלי בין רקמה לאלקטרודה. פרוטוקול זה הוא ספציפי למכרסמים ויש להתאים אותו אם הוא מיושם על מין מעבדה אחר. הנקודות הקריטיות, השינויים והמגבלות של המתודולוגיה מוצגים בפירוט.
זריקות תוך ויטריאליות
זריקות נמצאות בשימוש נרחב להעברת גנים עיניים, כאשר זריקות תוך ויטריאליות הן ההליך המועדף. הם הוכחו כבטוחים יותר ופחות פולשניים בהשוואה לזריקות תת-רשתית, אשר מציגות את המולקולות המעניינות ישירות בין הפוטורצפטורים לבין אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), ומסתכנות בהיפרדות רשתית10. עם זאת, ישנן מגבלות, במיוחד בעת ביצוע זריקות אלה במודלים מכרסמים. הומור הזגוגית הוא ג’לטיני, מעכב דיפוזיה ויראלית. יתר על כן, העדשה בעיני מכרסם היא גדולה, מה שהופך את זה לא טריוויאלי להחדיר את המחט מבלי לשרוט אותה. מחטי המזרק המדויקות עדינות ויש להחליף אותן לעתים קרובות. כדי למנוע חסימה, שטפו אותם במים נטולי יונים, לפני ואחרי כל שימוש והחליפו אותם באופן קבוע. בנוסף, יש להזריק את התוכן באיטיות כדי למנוע ריפלוקס תמיסה ושינויים בלחץ התוך עיני. השגת פלואורסצנטיות גדולה ואחידה על פני הרשתית עשויה לדרוש תרגול.
התמרה של תאי רשתית
וקטורים נגיפיים הם שיטה מצוינת להעברת גנים in vivo, ו- AAVs נמצאים בשימוש נרחב להמרת תאי רשתית10. הם אושרו כטיפול בכמה רטינופתים הגורמים לעיוורון אנושי24. עם זאת, קיבולת הנשא שלהם מוגבלת ל- 5 קילו-בתים, כולל האלמנטים הרגולטוריים הנדרשים (למשל, המקדם)10,25. ישנם מספר סרוטיפים זמינים, כל אחד עם טרופיזם שונה. בחר את AAV המתאים ביותר בהתבסס על הגנים שיועברו והתאים שיועברו26. עבור תיוג RGCs, מומלץ להשתמש AAV227.
חלון ביטוי גנים
הביטוי הנגיפי האופטימלי עבור AAV2-CAG-GCaMP5G הוא 2 עד 3 שבועות לאחר הזרקת12,18. מעבר לפרק זמן זה, הגרעינים של תאים נגועים הופכים פלואורסצנטיים, תאים מפסיקים להגיב לגירויים, ובסופו של דבר מתים 7,28,29. זאת בשל ביטוי יתר של מחוון GCaMP, אשר translocated לתוך הגרעין. חלון הזמן לביטוי גנים אופטימלי ישתנה בהתאם לווקטור הנגיפי ולמקדםשנבחר 30 ויש לקבוע אותו באופן ניסיוני לפני שתמשיך בפרוטוקול זה.
מגע רקמות-אלקטרודות
לקבלת תוצאות אופטימליות וניתנות לשחזור, השגת מגע טוב בין רקמה לאלקטרודה היא חיונית. מגע לקוי נובע בדרך כלל מהעקמומיות הטבעית של הרשתית. גישה אחת היא לחתוך את הרשתית לרבעים, להרכיב ולצלם קטע אחד בכל פעם. חלקים קטנים של הרשתית יכולים להיות שטוחים טוב יותר, וכתוצאה מכך מגע יעיל יותר עם פני השטח של MEA. סיבה אפשרית נוספת למגע לקוי היא נוכחות של הומור זגוגית. בעת ביצוע ניסויי גירוי המדמים שתל אפי-רשתית, חשוב להסיר בזהירות את הומור הזגוגית במהלך כריתת הרשתית מכיוון שהוא יכול לשמש כמבודד לזרם. כאן, שיטה פשוטה מתוארת כדי לבדוק אם המגע מספיק על ידי הדמיה של האלקטרודה והתאים באותו מישור מוקד.
חלופה למדידות רשתית ex vivo היא לגדל נוירונים ישירות על פני השטח של האלקטרודות. תרבית ראשונית של נוירונים, כגון נוירונים בהיפוקמפוס31, יכולה להיות שימושית לבדיקות ראשוניות כדי להעריך את הפונקציונליות של המכשיר המגרה החדש. עם זאת, גישה זו עדיין דורשת שימוש בחיות מעבדה ואינה מייצגת את המורכבות של רשת הרשתית, החשובה להערכת תגובות סינפטיות לגירוי.
כדי להמחיש את התאים שמתחת לעקבות האלקטרודות והאלקטרודות, MEAs המיוצרים מחומרים שקופים כגון תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) יכולים לשמש 19,20,32. בנוסף למדידות אופטיות, ניתן להעריך את פעילות GCL על גירוי חשמלי באמצעות הקלטות חשמליות. ניתן להשתמש ב-MEA כדי לרשום את פוטנציאל השדה המקומי (LFP) של הרקמה. עם זאת, הדבר פוגע ברזולוציה המרחבית, שכן כל אלקטרודה לוכדת פעילות מספר תאים בו זמנית (בהתאם לממדי האלקטרודה). הקלטה אופטית מתגברת על מגבלה זו ומציעה מיפוי ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר. היתרון העיקרי שלה הוא היכולת להבחין בין תאים פעילים ולא פעילים תוך מדידת FOV גדול עם רזולוציה של תא בודד. מבין כל מדווחי הפעילות התאית, מדדי סידן מתוארים היטב ונמצאים בשימוש הנפוץ ביותר33.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרס ריבאס, אנחל סנדובל, חסוס פלאנגומה, ג’ורדי קורטס, סנדרה אורטונובס לארה ואלינה הירשמן (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) על תמיכתם הטכנית, לאנה דוארי (VHIR, מכון המחקר ואל ד’חברון) מקבוצת המחקר לרפואת עיניים על תמיכתם בזריקות התוך ויטריאליות ובהדמיית הרשתית in vivo .
גופי המימון שתמכו בעבודה זו הם: Fundació CELLEX; פונדאסיו מיר-פויג; Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa תוכנית למרכזי מצוינות במו”פ (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya באמצעות תוכנית CERCA; לייזרלאב-אירופה (EU-H2020 GA מס’ 871124); קרן La Caixa (LCF/HR19/52160003); ו-Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C).
Materials
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | – |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | – |
| 30 G needle | VWR | 613-5373 | – |
| 36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | – |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | – |
| AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | – | – |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | – |
| Blade | Swann-morton | 0308 | – |
| Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | – |
| Carbogen | Air liquide | – | – |
| Curved-forceps | – | – | – |
| Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | – |
| FITC filter cube | Nikon | Standard series | – |
| Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | – |
| Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | – |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | – |
| ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | – |
| In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | – |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | – |
| Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | – | – |
| Long-Evans rat | Janvier | – | – |
| MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | – | – |
| Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | – |
| Methocel 2% | Omni Vision | – | – |
| Microelectrode array (MEA) | – | Custom-made | |
| NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | – |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | – |
| Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
| Plastic pipette | VWR | 612-1793 | – |
| Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | – |
| Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | – |
| Prescaina | Llorens | – | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
| Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | – |
| Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | – |
| Spring-scissors | FST | 15040-11 | – |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | – |
| Straight forceps | FST | 11252-20 | – |
| Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
| Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | – | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
| Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
| Washer | Thorlabs | W8S038 | – |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections. British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).
- Li, J. Q., et al. Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).
- Roska, B., Sahel, J. A. Restoring vision. Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).
- Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. Implantable Sensor Systems for Medical Applications. , 469-496 (2013).
- Lewis, P. M., et al. Advances in implantable bionic devices for blindness: a review. ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).
- Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision. Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. The ocular gene delivery landscape. Biomolecules. 11 (8), 1135 (2021).
- Hanlon, K. S., et al. A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529, 345-350 (2016).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615, 884-891 (2023).
- Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K. NIH Guidelines April 2019. Applied Biosafety. 24, (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chang, Y. -. C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system. Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018 (2017).
- Weitz, A. C., et al. Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration. Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).
- Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction. Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017 (2019).
- Im, M., Fried, S. I. Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002 (2016).
- Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).
- Ramos, M. S., et al. Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors. Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).
- Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. Developing new vectors for retinal gene therapy. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291 (2023).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Hellström, M., et al. Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection. Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).
- Yang, Y., et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nature Communications. 9, 1504 (2018).
- Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters. Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).
- Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis. Journal of Visualized Experiments. 184, e63829 (2022).
- Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
