Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas
Summary
Este protocolo presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando condiciones de cultivo en suspensión. El énfasis principal de este estudio radica en la determinación de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT, lo que beneficia a los investigadores interesados en la investigación de organoides renales.
Abstract
Los organoides renales se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a través de varios enfoques. Estos organoides son muy prometedores para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las posibles aplicaciones terapéuticas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para crear organoides renales a partir de iPSCs, comenzando desde la estría primitiva posterior (PS) hasta el mesodermo intermedio (IM). El enfoque se basa en el medio APEL 2, que es un medio definido y libre de componentes animales. Se complementa con una alta concentración de agonista WNT (CHIR99021) durante 4 días, seguido de factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina y una baja concentración de CHIR99021 durante 3 días adicionales. Durante este proceso, se hace hincapié en la selección de la densidad celular óptima y la concentración de CHIR99021 al inicio de las iPSC, ya que estos factores son críticos para la generación exitosa de organoides renales. Un aspecto importante de este protocolo es el cultivo en suspensión en una placa de baja adherencia, lo que permite que el IM se desarrolle gradualmente en estructuras nefronas, que abarcan estructuras tubulares glomerulares, tubulares proximales y tubulares distales, todas presentadas en un formato visualmente comprensible. En general, este protocolo detallado ofrece una técnica eficiente y específica para producir organoides renales a partir de diversas iPSC, lo que garantiza resultados exitosos y consistentes.
Introduction
El riñón desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica, dependiendo de su unidad funcional. Las nefronas, que excretan productos de desecho, pueden regular la composición de los fluidos corporales. La enfermedad renal crónica (ERC), causada por mutaciones hereditarias u otros factores de alto riesgo, eventualmente progresará a enfermedad renal terminal (IRT)1,2. Aparentemente, la IRT se debe a la limitada capacidad de regeneración de las nefronas. Por lo tanto, se requiere terapia de reemplazo renal. La diferenciación dirigida de las iPSC humanas permite la generación in vitro de organoides renales 3D específicos para cada paciente, que pueden utilizarse para estudiar el desarrollo renal, modelar enfermedades específicas del paciente y realizar el cribado de fármacos nefrotóxicos 3,4.
Durante el desarrollo embrionario, los riñones se originan en el mesodermo intermedio (MI), que se diferencia de la estría primitiva (PS). La vía de señalización clásica WNT puede inducir una diferenciación adicional de la IM con la participación coordinada de FGF (FGF9, FGF20) y BMP (señalización Bmp7 a través de JNK)5,6,7. Producen dos importantes poblaciones celulares de células progenitoras nefríticas (NPC): la yema ureteral (UB) y el mesénquima metanéfrico (MM), formando los conductos colectores y la nefrona, respectivamente 8,9. Cada nefrona está formada por segmentos glomerulares y tubulares, como los túbulos proximal y distal, y el asa de Henle10,11. De acuerdo con la teoría mencionada anteriormente, los protocolos actualmente publicados imitan las cascadas de señales y la estimulación del factor de crecimiento para inducir organoides renales 5,12.
En los últimos años, se han desarrollado muchos protocolos para diferenciar las iPSC humanas en organoides renales 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimizaron la duración del tratamiento con CHIR (agonista WNT) antes de la sustitución por FGF9. De acuerdo con su protocolo, la exposición a CHIR durante 4 días, seguida de FGF9 durante 3 días, es la forma más efectiva de inducir IM de iPSC. Se utilizaron filtros Transwell como formato de cultivo en su procedimiento; Sin embargo, este método es difícil para los principiantes. Por lo tanto, Kumar et al.13 intentaron cambiar el formato de la cultura y optaron por suspenderla. Disociaron las células adherentes en el día 7 para sembrarlas en placas de baja adherencia para ayudarlas a ensamblarse en cuerpos embrioides (EB) que contienen estructuras similares a nefronas. Sin embargo, el efecto por lotes de estos métodos fue evidente, especialmente en diferentes iPSC. Además, diferentes literaturas reportaron que la concentración de CHIR varió de 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Especulamos que la concentración de densidad celular y el CHIR podrían afectar a la generación de organoides en diferentes iPSCs, y esto se ha comprobado en numerosas ocasiones en nuestros experimentos. El presente protocolo ha modificado ligeramente el método de estudio de Kumar et al.13 y ha proporcionado a los usuarios un procedimiento paso a paso. El cronograma y el esquema del enfoque se muestran en la Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha descrito un protocolo detallado para la generación de organoides renales a partir de iPSCs, que implica modificaciones menores en el medio basal, la densidad celular inicial y la concentración de CHIR99021. En varios experimentos, se encontró que los factores críticos para la generación exitosa de organoides renales eran la diferenciación inicial del mesodermo intermedio (MI) y el estado celular en el día 7. Además, diferentes líneas de iPSC exhibieron variaciones en la proliferación celular y el potencia…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a todos los miembros de Mao y Hu Lab, pasados y presentes, por las interesantes discusiones y las grandes contribuciones al proyecto. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil por el gran apoyo. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang de China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (Subvenciones No. BK20210150 a Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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