Generazione di organoidi renali in sospensione da cellule staminali pluripotenti indotte
Summary
Questo protocollo presenta un metodo completo ed efficiente per la produzione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando condizioni di coltura in sospensione. L’enfasi principale di questo studio risiede nella determinazione della densità cellulare iniziale e della concentrazione dell’agonista WNT, avvantaggiando così i ricercatori interessati alla ricerca sugli organoidi renali.
Abstract
Gli organoidi renali possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) attraverso vari approcci. Questi organoidi sono molto promettenti per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le potenziali applicazioni terapeutiche. Questo articolo presenta una procedura passo-passo per creare organoidi renali da iPSC, a partire dalla striscia primitiva posteriore (PS) fino al mesoderma intermedio (IM). L’approccio si basa sul terreno APEL 2, che è un mezzo definito, privo di componenti animali. È integrato con un’alta concentrazione di agonista WNT (CHIR99021) per una durata di 4 giorni, seguita da fattore di crescita dei fibroblasti 9 (FGF9)/eparina e una bassa concentrazione di CHIR99021 per altri 3 giorni. Durante questo processo, viene data enfasi alla selezione della densità cellulare ottimale e della concentrazione di CHIR99021 all’inizio delle iPSC, poiché questi fattori sono fondamentali per il successo della generazione di organoidi renali. Un aspetto importante di questo protocollo è la coltura in sospensione in una placca a bassa aderenza, che consente all’IM di svilupparsi gradualmente in strutture nefroniche, comprendenti strutture tubulari glomerulari, tubolari prossimali e distali, tutte presentate in un formato visivamente comprensibile. Nel complesso, questo protocollo dettagliato offre una tecnica efficiente e specifica per produrre organoidi renali da diverse iPSC, garantendo risultati positivi e coerenti.
Introduction
Il rene svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi fisiologica, a seconda della sua unità funzionale. I nefroni, che espellono i prodotti di scarto, possono regolare la composizione dei fluidi corporei. La malattia renale cronica (CKD), causata da mutazioni ereditarie o da altri fattori ad alto rischio, progredisce fino alla malattia renale allo stadio terminale (ESKD)1,2. L’ESKD è apparentemente dovuta alla limitata capacità di rigenerazione dei nefroni. Pertanto, è necessaria una terapia sostitutiva renale. La differenziazione diretta delle iPSC umane consente la generazione in vitro di organoidi renali 3D specifici per il paziente, che possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo renale, modellare malattie specifiche del paziente ed eseguire lo screening dei farmaci nefrotossici 3,4.
Durante lo sviluppo embrionale, i reni originano dal mesoderma intermedio (IM), che si differenzia dalla stria primitiva (PS). La classica via di segnalazione WNT può indurre un’ulteriore differenziazione dell’IM con la partecipazione coordinata di FGF (FGF9, FGF20) e BMP (segnalazione Bmp7 attraverso JNK)5,6,7. Producono due importanti popolazioni cellulari di cellule progenitrici nefriche (NPC): la gemma ureterale (UB) e il mesenchima metanefrico (MM), formando rispettivamente i dotti collettori e il nefrone 8,9. Ogni nefrone è costituito da segmenti glomerulari e tubolari, come i tubuli prossimali e distali, e l’ansa di Henle10,11. Secondo la teoria sopra menzionata, i protocolli attualmente pubblicati imitano le cascate di segnale e la stimolazione del fattore di crescita per indurre gli organoidi renali 5,12.
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati molti protocolli per differenziare le iPSC umane in organoidi renali 5,6,7,12. Takasato et al.7 hanno ottimizzato la durata del trattamento con CHIR (agonista WNT) prima della sostituzione con FGF9. Secondo il loro protocollo, l’esposizione a CHIR per 4 giorni, seguita da FGF9 per 3 giorni, è il modo più efficace per indurre IM da iPSC. I filtri Transwell sono stati utilizzati come formato di coltura nella loro procedura; Tuttavia, questo metodo è difficile per i principianti. Pertanto, Kumar et al.13 hanno cercato di cambiare il formato della cultura e hanno scelto di sospendere la cultura. Hanno dissociato le cellule aderenti il giorno 7 per la semina in piastre a bassa aderenza per aiutarle ad assemblarsi in corpi embrioidi (EB) che contengono strutture simili a nefroni. Tuttavia, l’effetto batch di questi metodi era evidente, specialmente in diverse iPSC. Inoltre, diverse pubblicazioni hanno riportato che la concentrazione di CHIR variava da 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Abbiamo ipotizzato che la concentrazione della densità cellulare e del CHIR potesse influenzare la generazione di organoidi in diverse iPSC, e questo è stato verificato numerose volte nei nostri esperimenti. Il presente protocollo ha leggermente modificato il metodo di studio di Kumar et al.13 e ha fornito agli utenti una procedura passo-passo. La pianificazione e lo schema dell’approccio sono mostrati nella Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato descritto un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi renali da iPSC, che comporta piccole modifiche al mezzo basale, alla densità cellulare iniziale e alla concentrazione di CHIR99021. In vari esperimenti, i fattori critici per il successo della generazione di organoidi renali sono risultati essere la differenziazione iniziale del mesoderma intermedio (IM) e lo stato cellulare il giorno 7. Inoltre, diverse linee di iPSC hanno mostrato variazioni nella proliferazione cellulare e nel potenziale di …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo estremamente grati a tutti i membri di Mao e Hu Lab, passati e presenti, per le interessanti discussioni e i grandi contributi al progetto. Ringraziamo il Centro Nazionale di Ricerca Clinica per la Salute del Bambino per il grande supporto. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), dalla Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu), e la Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Jiangsu (Sovvenzioni n. BK20210150 a Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
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