从诱导多能干细胞中产生悬浮液中的肾脏类器官
Summary
该方案提供了一种使用悬浮培养条件从诱导多能干细胞（iPSC）生产肾脏类器官的全面有效的方法。本研究的主要重点在于确定初始细胞密度和 WNT 激动剂浓度，从而使对肾脏类器官研究感兴趣的研究人员受益。
Abstract
肾脏类器官可以通过多种方法从诱导多能干细胞 （iPSC） 中产生。这些类器官在疾病建模、药物筛选和潜在的治疗应用方面具有巨大的前景。本文介绍了从 iPSC 创建肾脏类器官的分步过程，从后原始条纹 （PS） 到中间中胚层 （IM）。该方法依赖于 APEL 2 培养基，这是一种确定的、不含动物成分的培养基。它补充高浓度的 WNT 激动剂 （CHIR99021），持续 4 天，然后补充成纤维细胞生长因子 9 （FGF9）/肝素和低浓度的 CHIR99021，持续 3 天。在此过程中，重点是在 iPSC 开始时选择最佳细胞密度和CHIR99021浓度，因为这些因素对于成功生成肾脏类器官至关重要。该协议的一个重要方面是在低贴壁板中悬浮培养，允许 IM 逐渐发育成肾单位结构，包括肾小球、近端肾小管和远端肾小管结构，所有这些都以视觉上可理解的形式呈现。总体而言，该详细方案提供了一种有效且特定的技术，可从不同的iPSC中生产肾脏类器官，从而确保成功和一致的结果。
Introduction
肾脏在维持生理稳态方面起着关键作用，具体取决于其功能单位。排泄废物的肾单位可以调节体液的成分。由遗传突变或其他高危因素引起的慢性肾脏病 （CKD） 最终会发展为终末期肾病 （ESKD）1,2。ESKD显然是由于肾单位的再生能力有限。因此，需要肾脏替代疗法。人类 iPSC 的定向分化能够在体外生成患者特异性 3D 肾脏类器官，可用于研究肾脏发育、模拟患者特定疾病和进行肾毒性药物筛选 3,4。
在胚胎发育过程中，肾脏起源于中间中胚层 （IM），这与原始条纹 （PS） 不同。经典的 WNT 信号通路可能在 FGF （FGF9， FGF20） 和 BMP （通过 JNK 的 Bmp7 信号转导）的协调参与下诱导 IM 的额外分化5,6,7。它们产生肾祖细胞 （NPC） 的两个重要细胞群：输尿管芽 （UB） 和肾间充质 （MM），分别形成集合管和肾单位 8,9。每个肾单位由肾小球和肾小管段组成，例如近端和远端小管，以及 Henle10,11 的环。根据上述理论，目前发表的方案模拟信号级联和生长因子刺激以诱导肾脏类器官5,12。
在过去的几年中，已经开发了许多方案来将人类 iPSC 区分为肾脏类器官 5,6,7,12。Takasato 等 7 优化了 FGF9 替代前 CHIR（WNT 激动剂）治疗的持续时间。根据他们的方案，CHIR 暴露 4 天，然后 FGF9 暴露 3 天，是诱导 iPSC IM 的最有效方法。Transwell过滤器在其程序中用作培养形式;但是，这种方法对于初学者来说很困难。因此，Kumar et al.13 试图改变文化形式，选择暂停文化。他们在第 7 天解离贴壁细胞，以接种在低贴壁板中，以帮助它们组装成含有肾单位样结构的胚状体 （EB）。然而，这些方法的批量效应是显而易见的，尤其是在不同的iPSC中。此外，不同的文献报道了 CHIR 的浓度从 7 μM 到 12 μM 不等 5,13,14。
我们推测细胞密度和CHIR的浓度可能会影响不同iPSC中类器官的产生，这在我们的实验中已经得到了多次验证。本方案略微修改了Kumar等人的研究方法13 ，并为用户提供了分步程序。该方法的时间表和示意图如图 1所示。
Protocol
Representative Results
Discussion
已经描述了从 iPSC 生成肾脏类器官的详细方案，包括对基础培养基、初始细胞密度和CHIR99021浓度的微小修改。在各种实验中，发现成功产生肾脏类器官的关键因素是中间中胚层 （IM） 的初始分化和第 7 天的细胞状态。此外，不同的iPSC细胞系表现出细胞增殖和分化潜力的变化，导致不同的最佳细胞密度和CHIR99021浓度5,13,14。因此…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们非常感谢所有毛和胡实验室成员，无论是过去还是现在，都对这个项目进行了有趣的讨论和巨大贡献。我们感谢国家儿童健康临床研究中心的大力支持。本研究由国家自然科学基金（U20A20351建华毛，82200784立单胡）、浙江省自然科学基金（No.LQ22C070004力丹胡）和江苏省自然科学基金（批准号）BK20210150给王刚）。
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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