Riktad metabolomik på sällsynta primära celler

Metabolism är en essentiell biologisk process som sker i alla levande celler. Metaboliska processer involverar ett stort nätverk av biokemiska reaktioner som är tätt reglerade och sammankopplade, vilket gör det möjligt för celler att producera energi och syntetisera viktiga biomolekyler¹. För att förstå funktionen hos metaboliska nätverk mäter forskarna nivåerna av småmolekylära intermediärer i celler. Dessa intermediärer fungerar som viktiga indikatorer på metabolisk aktivitet och kan avslöja viktiga insikter om cellulär funktion.

Masspektrometri (MS) är det mest populära valet för specifik detektion av metaboliter i komplexa prover ^1,2. Kärnmagnetisk resonans (NMR) har fördelar när det gäller absolut kvantifiering av föreningar och strukturbestämning, men MS kan ofta lösa upp fler komponenter i komplexa blandningar som biovätskor eller cellextrakt. Oftast kombineras MS med tidigare separation av föreningen genom kapillärelektrofores (CE), gaskromatografi (GC) eller vätskekromatografi (LC)³. Valet av separationsplattform styrs främst av utbudet av målmetaboliter och typen av prov och, i en verklig miljö, av tillgången på maskiner och expertis. Alla tre separationsplattformarna har ett brett och överlappande utbud av lämpliga metaboliter men olika begränsningar. Kortfattat kan CE endast separera laddade molekyler och kräver mycket expertis för att genomföra robust analys av ett stort antal prover⁴. GC är begränsat till molekyler som är små och apolära nog att avdunsta innan de sönderdelas³. Med tanke på alla kommersiellt tillgängliga LC-kolonner kan vilka två metaboliter som helst separeras med denna teknik⁵. Många LC-metoder uppvisar dock mindre upplösningsförmåga än CE- eller GC-metoder av liknande längd.

Den typiska mängden utgångsmaterial för metabolomikmätningar ligger vanligtvis i intervallet 5 x 10⁵ till 5 x 10⁷ celler per prov, 5-50 mg våt vävnad eller 5-50 μL kroppsvätska⁶. Det kan dock vara svårt att få tag på sådana mängder utgångsmaterial när man arbetar med primära celler av sällsynta celltyper, som till exempel hematopoetiska stamceller (HSC) eller cirkulerande tumörceller. Dessa celler finns ofta i mycket små antal och kan inte odlas utan att kompromissa med kritiska cellulära egenskaper.

HSC och multipotenta progenitorceller (MPP) är de minst differentierade cellerna i det hematopoetiska systemet och producerar kontinuerligt nya blodceller under en organisms liv. Regleringen av hematopoes är av klinisk relevans vid tillstånd som leukemi och anemi. Trots sin betydelse är HSC och MPP bland de mest sällsynta cellerna i det hematopoetiska systemet. Från en enda mus kan vanligtvis cirka 5000 HSC:er isoleras ^7,8,9. Eftersom traditionella metabolomikmetoder kräver mer ingående material var det ofta nödvändigt att slå samman celler från flera möss för att analysera sällsynta celltyper^10,11.

Här syftade vi till att utveckla ett protokoll som möjliggör mätning av metaboliter i så lite som 5000 celler per prov för att möjliggöra generering av metabolomikdata från HSCs från en enda mus¹². Samtidigt gör denna metod det möjligt att generera flera replikat från en enda mus för rikligare celltyper som lymfocyter. Detta tillvägagångssätt minskar antalet djur som krävs för ett visst projekt, vilket bidrar till “3R” (minskning, ersättning, förfining) av djurförsök.

Metaboliter i celler kan ha mycket höga omsättningshastigheter, ofta i storleksordningen^{sekunder 13}. Att förbereda prover för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan dock ta timmar, och själva FACS-sorteringen kan ta minuter till timmar, vilket leder till potentiella förändringar i metabolomet på grund av icke-fysiologiska förhållanden. Vissa av de reagenser som används i detta protokoll (t.ex. ammonium-klorid-kalium [ACK] lysbuffert) kan ha liknande effekter. Dessa tillstånd kan orsaka cellulär stress och påverka nivåerna och förhållandena av metaboliter i celler, vilket leder till felaktiga eller partiska mätningar av cellulär metabolism 14,15,16. De metaboliska förändringarna på grund av provberedning kallas ibland sorteringsartefakter. Långa matsmältningsprotokoll och starka reagenser som kan krävas för att producera encellssuspensioner från hårda eller hårda vävnader kan förvärra detta problem. Vilka förändringar som kan uppstå beror sannolikt på celltypen och bearbetningsförhållandena. Den exakta karaktären av förändringarna är fortfarande okänd, eftersom det metaboliska tillståndet hos de ostörda cellerna i den levande vävnaden inte kan mätas.

Protokollet som presenteras här innehåller flera viktiga skillnader jämfört med traditionella metoder, nämligen användningen av 5 g/L NaCl som mantelvätska, sortering direkt i extraktionsbuffert, injicering av stora provvolymer på hydrofil interaktion vätskekromatografi-masspektrometri (HILIC-MS), och användning av riktad kvantifiering, rigorös användning av interna standarder och bakgrundskontroller (Figur 1). Detta protokoll har potential att i^{stor utsträckning bevara} skillnader mellan celltyper och mellan läkemedelsbehandling och vehikelkontroll. Även för odlade celler kan det jämföras med alternativa metoder, såsom den mer etablerade centrifugeringen och manuell borttagning av supernatant. Men eftersom sorteringsartefakter fortfarande kan uppstå måste data tolkas med försiktighet. Trots denna begränsning representerar protokollet en betydande förbättring inom området metabolisk profilering, vilket möjliggör mer exakta och omfattande mätningar av cellulär metabolism i sällsynta primära celler¹².

Möjligheten att på ett robust sätt mäta breda metaboliska profiler i sällsynta primära celler öppnar dörren för nya experiment inom biomedicinsk forskning som involverar dessa celler. Till exempel har metaboliskt medierad reglering i HSC visat sig påverka förmågan att förnya sig i dvala, med implikationer för anemi och leukemi^11,17. I cirkulerande tumörceller från patienter har skillnader i uttrycket av metabola gener mellan tumör och intilliggande celler visats^18,19. Detta protokoll gör det nu möjligt för forskare att studera dessa skillnader systematiskt på en metabolisk nivå, som allmänt anses ligga närmare den cellulära fenotypen än genuttrycket.