दुर्लभ प्राथमिक कोशिकाओं पर लक्षित चयापचय
Summary
यहां, हम दुर्लभ सेल प्रकारों में चयापचयों को सटीक और मज़बूती से मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सेल छँटाई और प्रासंगिक रिक्त नमूनों की पीढ़ी के लिए एक संशोधित म्यान तरल पदार्थ सहित तकनीकी सुधार, नमूना प्रति केवल 5000 कोशिकाओं के इनपुट के साथ चयापचयों की एक व्यापक मात्रा का ठहराव सक्षम.
Abstract
सेलुलर फ़ंक्शन गंभीर रूप से चयापचय पर निर्भर करता है, और अंतर्निहित चयापचय नेटवर्क के कार्य का अध्ययन छोटे अणु मध्यवर्ती को मापकर किया जा सकता है। हालांकि, सेलुलर चयापचय के सटीक और विश्वसनीय माप प्राप्त करना, विशेष रूप से हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं जैसे दुर्लभ सेल प्रकारों में, पारंपरिक रूप से कई जानवरों से पूलिंग कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। एक प्रोटोकॉल अब शोधकर्ताओं को प्रति नमूना केवल एक माउस का उपयोग करके दुर्लभ सेल प्रकारों में चयापचयों को मापने में सक्षम बनाता है, जबकि अधिक प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के लिए कई प्रतिकृतियां उत्पन्न करता है। यह किसी दिए गए प्रोजेक्ट के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस तरह के एक म्यान तरल पदार्थ के रूप में 5 जी / एल NaCl का उपयोग करने, acetonitrile में सीधे छँटाई, और आंतरिक मानकों के कठोर उपयोग के साथ लक्षित मात्रा का ठहराव का उपयोग के रूप में पारंपरिक metabolomics प्रोटोकॉल पर कई महत्वपूर्ण मतभेद शामिल हैं, सेलुलर चयापचय के अधिक सटीक और व्यापक माप के लिए अनुमति देता है. एकल कोशिकाओं, फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना और छँटाई के अलगाव के लिए आवश्यक समय के बावजूद, प्रोटोकॉल काफी हद तक सेल प्रकार और दवा उपचार के बीच अंतर को संरक्षित कर सकता है।
Introduction
चयापचय एक आवश्यक जैविक प्रक्रिया है जो सभी जीवित कोशिकाओं में होती है। मेटाबोलिक प्रक्रियाओं में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का एक विशाल नेटवर्क शामिल होता है जो कसकर विनियमित और परस्पर जुड़े होते हैं, जिससे कोशिकाओं को ऊर्जा का उत्पादन करने और आवश्यक बायोमोलेक्यूल्सको संश्लेषित करने की अनुमति मिलती है। चयापचय नेटवर्क के कार्य को समझने के लिए, शोधकर्ता कोशिकाओं के भीतर छोटे अणु मध्यवर्ती के स्तर को मापते हैं। ये मध्यवर्ती चयापचय गतिविधि के महत्वपूर्ण संकेतक के रूप में कार्य करते हैं और सेलुलर फ़ंक्शन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकते हैं।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) जटिल नमूनों 1,2 में चयापचयों की विशिष्ट पहचान के लिए सबसे लोकप्रिय विकल्प है. परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) में यौगिकों और संरचना स्पष्टीकरण के पूर्ण परिमाणीकरण में फायदे हैं, लेकिन एमएस अक्सर जटिल मिश्रण जैसे बायोफ्लुइड या सेल अर्क में अधिक घटकों को हल कर सकता है। अधिक बार नहीं, एमएस को केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई), गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी), या तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी)3द्वारा यौगिक के पूर्व पृथक्करण के साथ जोड़ा जाता है। पृथक्करण मंच की पसंद ज्यादातर लक्ष्य चयापचयों की सीमा और नमूने के प्रकार से और वास्तविक दुनिया की सेटिंग में, मशीनों और विशेषज्ञता की उपलब्धता से प्रेरित होती है। सभी तीन पृथक्करण प्लेटफार्मों में उपयुक्त चयापचयों की एक व्यापक और अतिव्यापी सीमा है लेकिन विभिन्न सीमाएं हैं। संक्षेप में, सीई केवल चार्ज अणुओं को अलग कर सकता है और बड़ी संख्यामें नमूनों के मजबूत विश्लेषण को लागू करने के लिए बहुत सारी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। जीसी उन अणुओं तक सीमित है जो छोटे और एपोलर होते हैं जो3 को विघटित करने से पहले वाष्पित हो जाते हैं। सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलसी कॉलम को ध्यान में रखते हुए, किसी भी दो चयापचयों को इस तकनीक द्वारा अलग किया जा सकताहै 5. हालांकि, कई एलसी विधियां समान लंबाई के सीई या जीसी विधियों की तुलना में कम संकल्प शक्ति प्रदर्शित करती हैं।
मेटाबोलॉमिक्स माप के लिए प्रारंभिक सामग्री की विशिष्ट मात्रा आमतौर पर 5 x 105 से 5 x 107 कोशिकाओं प्रति नमूना, 5-50 मिलीग्राम गीले ऊतक, या शरीर के तरल पदार्थके 5-50 माइक्रोन की सीमा में होती है। हालांकि, दुर्लभ सेल प्रकारों की प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करते समय ऐसी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जैसे कि हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) या ट्यूमर कोशिकाओं को प्रसारित करना। ये कोशिकाएं अक्सर बहुत कम संख्या में मौजूद होती हैं और महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताओं से समझौता किए बिना खेती नहीं की जा सकती हैं।
एचएससी और मल्टीपोटेंट पूर्वज कोशिकाएं (एमपीपी) हेमटोपोइएटिक प्रणाली की कम से कम विभेदित कोशिकाएं हैं और एक जीव के पूरे जीवन में लगातार नई रक्त कोशिकाओं का उत्पादन करती हैं। हेमटोपोइजिस का विनियमन ल्यूकेमिया और एनीमिया जैसी स्थितियों में नैदानिक प्रासंगिकता का है। उनके महत्व के बावजूद, एचएससी और एमपीपी हेमटोपोइएटिक प्रणाली के भीतर सबसे दुर्लभ कोशिकाओं में से हैं। एक माउस से, आमतौर पर, लगभग 5000 एचएससी को 7,8,9 से अलग किया जा सकता है। पारंपरिक metabolomics तरीकों के रूप में अधिक इनपुट सामग्री की आवश्यकता होती है, कई चूहों से पूलिंग कोशिकाओं अक्सर दुर्लभ सेल प्रकार10,11 का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक था.
यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक माउस12 के एचएससी से metabolomics डेटा की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए नमूना प्रति 5000 कोशिकाओं के रूप में कम में चयापचयों के माप सक्षम बनाता है विकसित करने का लक्ष्य रखा. इसी समय, यह विधि लिम्फोसाइटों जैसे अधिक प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के लिए एक माउस से कई प्रतिकृतियां उत्पन्न करने की अनुमति देती है। यह दृष्टिकोण किसी दिए गए परियोजना के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है, इस प्रकार पशु प्रयोगों के “3R” (कमी, प्रतिस्थापन, शोधन) में योगदान देता है।
कोशिकाओं में चयापचयों में बहुत अधिक कारोबार दर हो सकती है, अक्सर सेकंड13 के क्रम में। हालांकि, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के लिए नमूने तैयार करने में घंटों लग सकते हैं, और एफएसीएस खुद को सॉर्ट करने में मिनटों से लेकर घंटों तक लग सकते हैं, जिससे गैर-शारीरिक स्थितियों के कारण मेटाबोलोम में संभावित परिवर्तन हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कुछ अभिकर्मकों (जैसे अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम [एके] लाइसिस बफर) के समान प्रभाव हो सकते हैं। इन स्थितियों सेलुलर तनाव पैदा कर सकता है और स्तर और कोशिकाओं के भीतर चयापचयों के अनुपात को प्रभावित, सेलुलर चयापचय 14,15,16 के गलत या पक्षपाती माप के लिए अग्रणी. नमूना तैयार करने के कारण चयापचय परिवर्तन को कभी-कभी सॉर्टिंग कलाकृतियों के रूप में जाना जाता है। लंबे पाचन प्रोटोकॉल और कठोर अभिकर्मकों कि कठिन या कठिन ऊतकों से एकल सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए आवश्यक हो सकता है इस मुद्दे को बढ़ा सकते हैं. क्या परिवर्तन हो सकते हैं संभावना सेल प्रकार और प्रसंस्करण की स्थिति पर निर्भर करता है। परिवर्तनों की सटीक प्रकृति अज्ञात बनी हुई है, क्योंकि जीवित ऊतक में अबाधित कोशिकाओं की चयापचय स्थिति को मापा नहीं जा सकता है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक म्यान तरल पदार्थ के रूप में 5 ग्राम / एल NaCl का उपयोग, निष्कर्षण बफर में सीधे छँटाई, हाइड्रोफिलिक बातचीत तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआईएलआईसी-एमएस) पर बड़े नमूना संस्करणों इंजेक्शन, पारंपरिक तरीकों की तुलना में कई महत्वपूर्ण मतभेद शामिल हैं, और लक्षित परिमाणीकरण, आंतरिक मानकों और पृष्ठभूमि नियंत्रण के कठोर उपयोग का उपयोग(चित्रा 1)). इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार के बीच और दवा उपचार और वाहन नियंत्रण के बीच एक काफी हद तक12 मतभेद को संरक्षित करने की क्षमता है. यहां तक कि सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, यह वैकल्पिक दृष्टिकोणों के अनुकूल तुलना करता है, जैसे कि अधिक स्थापित सेंट्रीफ्यूजेशन और सुपरनेटेंट के मैनुअल हटाने। हालाँकि, चूंकि कलाकृतियों को छाँटना अभी भी हो सकता है, डेटा की सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। इस सीमा के बावजूद, प्रोटोकॉल चयापचय रूपरेखा के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, दुर्लभ प्राथमिक कोशिकाओं12 में सेलुलर चयापचय के अधिक सटीक और व्यापक माप के लिए अनुमति देता है.
दुर्लभ प्राथमिक कोशिकाओं में व्यापक चयापचय प्रोफाइल को मजबूती से मापने की क्षमता इन कोशिकाओं से जुड़े जैव चिकित्सा अनुसंधान में नए प्रयोगों के लिए द्वार खोलती है। उदाहरण के लिए, एचएससी में चयापचय मध्यस्थता विनियमन को निष्क्रिय आत्म-नवीकरण क्षमता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, एनीमिया और ल्यूकेमिया 11,17के लिए निहितार्थ के साथ। रोगी व्युत्पन्न परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं में, ट्यूमर और आसन्न कोशिकाओं के बीच चयापचय जीन की अभिव्यक्ति में मतभेद 18,19दिखाया गया है. यह प्रोटोकॉल अब शोधकर्ताओं को चयापचय स्तर पर व्यवस्थित रूप से इन मतभेदों का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जिसे आमतौर पर जीन अभिव्यक्ति की तुलना में सेलुलर फेनोटाइप के करीब माना जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग लक्षित metabolomics के सफल कार्यान्वयन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं 1) एक मजबूत धुंधला और गेटिंग रणनीति है कि स्वच्छ सेल आबादी उपज जाएगा 2) तरल मात्रा की सटीक हैंडलिंग, 3) सभी प्रयोगात्मक च?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले जानवरों को प्रदान करने के लिए मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ इम्यूनोबायोलॉजी और एपिजेनेटिक्स की पशु सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
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