Gerichte metabolomics op zeldzame primaire cellen

Metabolisme is een essentieel biologisch proces dat in alle levende cellen voorkomt. Metabolische processen omvatten een uitgebreid netwerk van biochemische reacties die strak worden gereguleerd en met elkaar verbonden zijn, waardoor cellen energie kunnen produceren en essentiële biomoleculen kunnen synthetiseren^. Om de functie van metabole netwerken te begrijpen, meten onderzoekers de niveaus van intermediairen van kleine moleculen in cellen. Deze tussenproducten dienen als belangrijke indicatoren van metabole activiteit en kunnen kritische inzichten in de cellulaire functie onthullen.

Massaspectrometrie (MS) is de meest populaire keuze voor de specifieke detectie van metabolieten in complexe monsters ^1,2. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) heeft voordelen bij de absolute kwantificering van verbindingen en structuuropheldering, maar MS kan vaak meer componenten oplossen in complexe mengsels zoals biovloeistoffen of celextracten. Vaker wel dan niet, wordt MS gecombineerd met eerdere scheiding van de verbinding door capillaire elektroforese (CE), gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC)³. De keuze van het scheidingsplatform wordt meestal bepaald door het bereik van de doelmetabolieten en het type monster en, in de praktijk, door de beschikbaarheid van machines en expertise. Alle drie de scheidingsplatforms hebben een breed en overlappend scala aan geschikte metabolieten, maar verschillende beperkingen. Kortom, CE kan alleen geladen moleculen scheiden en vereist veel expertise om een robuuste analyse van een groot aantal monsters uit te voeren⁴. GC is beperkt tot moleculen die klein en apolair genoeg zijn om te verdampen voordat ze uiteenvallen³. Rekening houdend met alle in de handel verkrijgbare LC-kolommen, kunnen twee willekeurige metabolieten door deze technologie worden gescheiden⁵. Veel LC-methoden vertonen echter minder oplossend vermogen dan CE- of GC-methoden van vergelijkbare lengte.

De typische hoeveelheid uitgangsmateriaal voor metabolomics-metingen ligt meestal in het bereik van 5 x 10⁵ tot 5 x 10⁷ cellen per monster, 5-50 mg nat weefsel of 5-50 μL lichaamsvloeistof⁶. Het kan echter een uitdaging zijn om dergelijke hoeveelheden uitgangsmateriaal te verkrijgen bij het werken met primaire cellen van zeldzame celtypen, zoals bijvoorbeeld hematopoëtische stamcellen (HSC’s) of circulerende tumorcellen. Deze cellen zijn vaak in zeer lage aantallen aanwezig en kunnen niet worden gekweekt zonder kritieke cellulaire kenmerken in gevaar te brengen.

HSC’s en multipotente voorlopercellen (MPP’s) zijn de minst gedifferentieerde cellen van het hematopoëtische systeem en produceren gedurende het hele leven van een organisme voortdurend nieuwe bloedcellen. De regulatie van hematopoëse is van klinisch belang bij aandoeningen zoals leukemie en bloedarmoede. Ondanks hun belang behoren HSC’s en MPP’s tot de zeldzaamste cellen binnen het hematopoëtische systeem. Van een enkele muis kunnen doorgaans ongeveer 5000 HSC’s worden geïsoleerd ^7,8,9. Omdat traditionele metabolomics-methoden meer inputmateriaal vereisen, was het vaak nodig om cellen van meerdere muizen te bundelen om zeldzame celtypen te analyseren^10,11.

Hier wilden we een protocol ontwikkelen dat het mogelijk maakt om metabolieten te meten in slechts 5000 cellen per monster om het genereren van metabolomics-gegevens van de HSC’s van een enkele muis mogelijk te maken¹². Tegelijkertijd maakt deze methode het mogelijk om meerdere replicaten uit een enkele muis te genereren voor meer voorkomende celtypen zoals lymfocyten. Deze aanpak vermindert het aantal dieren dat nodig is voor een bepaald project en draagt zo bij aan de “3R” (vermindering, vervanging, verfijning) van dierproeven.

Metabolieten in cellen kunnen een zeer hoge omloopsnelheid hebben, vaak in de orde van seconden¹³. Het voorbereiden van monsters voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan echter uren duren, en FACS-sortering zelf kan minuten tot uren duren, wat leidt tot mogelijke veranderingen in het metaboloom als gevolg van niet-fysiologische omstandigheden. Sommige van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt (zoals ammoniumchloride-kalium [ACK] lysisbuffer) kunnen vergelijkbare effecten hebben. Deze omstandigheden kunnen cellulaire stress veroorzaken en de niveaus en verhoudingen van metabolieten in cellen beïnvloeden, wat leidt tot onnauwkeurige of bevooroordeelde metingen van het cellulaire metabolisme 14,15,16. De metabolische veranderingen als gevolg van monstervoorbereiding worden soms sorteerartefacten genoemd. Lange spijsverteringsprotocollen en agressieve reagentia die nodig kunnen zijn om eencellige suspensies te produceren uit harde of taaie weefsels, kunnen dit probleem verergeren. Welke veranderingen kunnen optreden, hangt waarschijnlijk af van het celtype en de verwerkingsconditie. De precieze aard van de veranderingen blijft onbekend, omdat de metabolische toestand van de ongestoorde cellen in het levende weefsel niet kan worden gemeten.

Het hier gepresenteerde protocol omvat een aantal belangrijke verschillen ten opzichte van traditionele methoden, namelijk het gebruik van 5 g/L NaCl als omhulselvloeistof, het rechtstreeks sorteren in de extractiebuffer, het injecteren van grote monstervolumes op hydrofiele interactievloeistofchromatografie-massaspectrometrie (HILIC-MS), en het gebruik van gerichte kwantificering, rigoureus gebruik van interne normen en achtergrondcontroles (Figuur 1). Dit protocol heeft de potentie om verschillen tussen celtypen en tussen medicamenteuze behandeling en mediumcontrole voor een groot deel in stand te houden^. Zelfs voor gekweekte cellen steekt het gunstig af bij alternatieve benaderingen, zoals de meer gevestigde centrifugatie en handmatige verwijdering van supernatant. Omdat er echter nog steeds sorteerartefacten kunnen optreden, moeten gegevens met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Ondanks deze beperking betekent het protocol een aanzienlijke verbetering op het gebied van metabole profilering, waardoor nauwkeurigere en uitgebreidere metingen van het cellulaire metabolisme in zeldzame primaire cellen mogelijk zijn^.

De mogelijkheid om brede metabole profielen in zeldzame primaire cellen robuust te meten, opent de deur naar nieuwe experimenten in biomedisch onderzoek met deze cellen. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat metabolisch gemedieerde regulatie in HSC’s van invloed is op het zelfvernieuwingsvermogen van de rustperiode, met implicaties voor bloedarmoede en leukemie^11,17. In van de patiënt afkomstige circulerende tumorcellen zijn verschillen in de expressie van metabole genen tussen tumor en aangrenzende cellen aangetoond^18,19. Dit protocol stelt onderzoekers nu in staat om deze verschillen systematisch te bestuderen op een metabolisch niveau, dat over het algemeen wordt beschouwd als dichter bij het cellulaire fenotype dan bij genexpressie.