Her præsenterer vi en protokol til nøjagtig og pålidelig måling af metabolitter i sjældne celletyper. Tekniske forbedringer, herunder en modificeret kappevæske til cellesortering og generering af relevante blindprøver, muliggør en omfattende kvantificering af metabolitter med et input på kun 5000 celler pr. prøve.
Cellulær funktion afhænger kritisk af stofskiftet, og funktionen af de underliggende metaboliske netværk kan studeres ved måling af små molekyler mellemprodukter. Imidlertid har opnåelse af nøjagtige og pålidelige målinger af cellulær metabolisme, især i sjældne celletyper som hæmatopoietiske stamceller, traditionelt krævet pooling af celler fra flere dyr. En protokol gør det nu muligt for forskere at måle metabolitter i sjældne celletyper ved kun at bruge en mus pr. Prøve, mens de genererer flere replikater til mere rigelige celletyper. Dette reducerer antallet af dyr, der kræves til et givet projekt. Protokollen, der præsenteres her, involverer flere vigtige forskelle i forhold til traditionelle metabolomics-protokoller, såsom anvendelse af 5 g / L NaCl som kappevæske, sortering direkte i acetonitril og anvendelse af målrettet kvantificering med streng brug af interne standarder, hvilket giver mulighed for mere nøjagtige og omfattende målinger af cellulær metabolisme. På trods af den tid, der kræves til isolering af enkeltceller, fluorescerende farvning og sortering, kan protokollen i vid udstrækning bevare forskelle mellem celletyper og lægemiddelbehandlinger.
Metabolisme er en væsentlig biologisk proces, der forekommer i alle levende celler. Metaboliske processer involverer et stort netværk af biokemiske reaktioner, der er tæt reguleret og sammenkoblet, hvilket gør det muligt for celler at producere energi og syntetisere essentielle biomolekyler1. For at forstå funktionen af metaboliske netværk måler forskere niveauerne af små molekylemellemprodukter i celler. Disse mellemprodukter tjener som vigtige indikatorer for metabolisk aktivitet og kan afsløre kritisk indsigt i cellulær funktion.
Massespektrometri (MS) er det mest populære valg til specifik påvisning af metabolitter i komplekse prøver 1,2. Kernemagnetisk resonans (NMR) har fordele ved absolut kvantificering af forbindelser og strukturbelysning, men MS kan ofte løse flere komponenter i komplekse blandinger såsom biofluider eller celleekstrakter. Oftere end ikke kombineres MS med forudgående adskillelse af forbindelsen ved kapillærelektroforese (CE), gaskromatografi (GC) eller væskekromatografi (LC)3. Valget af separationsplatform er for det meste drevet af rækken af målmetabolitter og prøvetypen og, i virkelige omgivelser, af tilgængeligheden af maskiner og ekspertise. Alle tre separationsplatforme har et bredt og overlappende udvalg af egnede metabolitter, men forskellige begrænsninger. Kort fortalt kan CE kun adskille ladede molekyler og kræver stor ekspertise for at gennemføre robust analyse af et stort antal prøver4. GC er begrænset til molekyler, der er små og apolære nok til at fordampe, før de nedbrydes3. I betragtning af alle kommercielt tilgængelige LC-kolonner kan to metabolitter adskilles ved hjælp af denne teknologi5. Imidlertid udviser mange LC-metoder mindre opløsningsevne end CE- eller GC-metoder af tilsvarende længde.
Den typiske mængde udgangsmateriale til metabolomics-målinger ligger normalt i området 5 x 105 til 5 x 107 celler pr. prøve, 5-50 mg vådt væv eller 5-50 μL kropsvæske6. Det kan dog være udfordrende at opnå sådanne mængder udgangsmateriale, når man arbejder med primære celler af sjældne celletyper, som for eksempel hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) eller cirkulerende tumorceller. Disse celler er ofte til stede i meget lavt antal og kan ikke dyrkes uden at gå på kompromis med kritiske cellulære egenskaber.
HSC’er og multipotente stamceller (MPP’er) er de mindst differentierede celler i det hæmatopoietiske system og producerer kontinuerligt nye blodlegemer gennem en organismes liv. Reguleringen af hæmatopoiesis er af klinisk relevans under tilstande som leukæmi og anæmi. På trods af deres betydning er HSC’er og MPP’er blandt de sjældneste celler i det hæmatopoietiske system. Fra en enkelt mus kan der typisk isoleres ca. 5000 HSC’er 7,8,9. Da traditionelle metabolomics-metoder kræver mere inputmateriale, var det ofte nødvendigt at samle celler fra flere mus for at analysere sjældne celletyper10,11.
Her havde vi til formål at udvikle en protokol, der muliggør måling af metabolitter i så lidt som 5000 celler pr. prøve for at muliggøre generering af metabolomics-data fra HSC’erne for en enkelt mus12. Samtidig gør denne metode det muligt at generere flere replikater fra en enkelt mus til mere rigelige celletyper som lymfocytter. Denne fremgangsmåde reducerer antallet af dyr, der kræves til et givet projekt, og bidrager således til “3R” (reduktion, erstatning, forfinelse) af dyreforsøg.
Metabolitter i celler kan have meget høje omsætningshastigheder, ofte i størrelsesordenensekunder 13. Imidlertid kan forberedelse af prøver til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) tage timer, og FACS-sortering i sig selv kan tage minutter til timer, hvilket fører til potentielle ændringer i metabolomet på grund af ikke-fysiologiske tilstande. Nogle af de reagenser, der anvendes i denne protokol (såsom ammoniumchlorid-kalium [ACK] lysisbuffer) kan have lignende virkninger. Disse tilstande kan forårsage cellulær stress og påvirke niveauerne og forholdet mellem metabolitter i celler, hvilket fører til unøjagtige eller partiske målinger af cellulær metabolisme 14,15,16. De metaboliske ændringer på grund af prøveforberedelse kaldes undertiden sorteringsartefakter. Lange fordøjelsesprotokoller og hårde reagenser, der kan være nødvendige for at producere enkeltcellesuspensioner fra hårdt eller hårdt væv, kan forværre dette problem. Hvilke ændringer der kan forekomme afhænger sandsynligvis af celletypen og behandlingstilstanden. Den præcise karakter af ændringerne er endnu ukendt, da stofskiftetilstanden af de uforstyrrede celler i det levende væv ikke kan måles.
Den protokol, der præsenteres her, involverer flere nøgleforskelle sammenlignet med traditionelle metoder, nemlig brugen af 5 g / L NaCl som kappevæske, sortering direkte i ekstraktionsbuffer, injektion af store prøvevolumener på hydrofil interaktion væskekromatografi-massespektrometri (HILIC-MS) og anvendelse af målrettet kvantificering, streng brug af interne standarder og baggrundskontrol (figur 1). Denne protokol har potentiale til at bevare forskelle mellem celletyper og mellem narkotikabehandling og køretøjskontrol i vid udstrækning12. Selv for dyrkede celler kan det sammenlignes positivt med alternative tilgange, såsom den mere etablerede centrifugering og manuel fjernelse af supernatant. Da sorteringsartefakter dog stadig kan forekomme, skal data fortolkes med forsigtighed. På trods af denne begrænsning repræsenterer protokollen en betydelig forbedring inden for metabolisk profilering, hvilket giver mulighed for mere nøjagtige og omfattende målinger af cellulær metabolisme i sjældne primære celler12.
Evnen til robust at måle brede metaboliske profiler i sjældne primære celler åbner døren for nye eksperimenter inden for biomedicinsk forskning, der involverer disse celler. For eksempel har metabolisk medieret regulering i HSC’er vist sig at påvirke hvilende selvfornyelseskapacitet med konsekvenser for anæmi og leukæmi11,17. I patientafledte cirkulerende tumorceller er forskelle i ekspression af metaboliske gener mellem tumor og tilstødende celler blevet vist18,19. Denne protokol giver nu forskere mulighed for systematisk at studere disse forskelle på et metabolisk niveau, som generelt betragtes som tættere på den cellulære fænotype end genekspression.
De mest kritiske trin for en vellykket implementering af målrettet metabolomics ved hjælp af denne protokol er 1) en robust farvnings- og gatingstrategi, der giver rene cellepopulationer, 2) præcis håndtering af væskevolumener, 3) reproducerbar timing af alle eksperimentelle trin, især alle trin før metabolitekstraktion. Ideelt set bør alle prøver, der tilhører et forsøg, behandles og måles i en batch for at minimere batcheffekter22. Ved større forsøg foreslår vi, at man samler cell…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke dyreanlægget ved Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics for at levere de dyr, der anvendes i denne undersøgelse.
13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
FACSAria III | BD | ||
Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |