Diagnóstico rápido basado en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de la infección por Helicobacter pylori y la resistencia a los antibióticos
Summary
El protocolo presenta un método no invasivo para el diagnóstico rápido de infecciones estomacales por Helicobacter pylori a través de la prueba de cadena y determina su resistencia a antibióticos a claritromicina y levofloxacino mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR).
Abstract
Helicobacter pylori es un importante patógeno humano que infecta aproximadamente a la mitad de la población mundial y se está convirtiendo en una grave amenaza para la salud debido a su creciente resistencia a los antibióticos. Es el agente causal de la gastritis crónica activa, la enfermedad de úlcera péptica y el cáncer gástrico y ha sido clasificado como un carcinógeno del Grupo I por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer. Por lo tanto, el diagnóstico rápido y preciso de H. pylori y la determinación de su resistencia a los antibióticos son importantes para la erradicación eficiente de este patógeno bacteriano. Actualmente, los métodos de diagnóstico de H. pylori incluyen principalmente la prueba de aliento con urea (UBT), la prueba de antígenos, la prueba de anticuerpos séricos, la gastroscopia, la prueba rápida de ureasa (RUT) y el cultivo bacteriano. Entre ellos, los tres primeros métodos de detección no son invasivos, lo que significa que son pruebas fáciles de realizar. Sin embargo, las bacterias no se pueden recuperar a través de estas técnicas; Por lo tanto, no se pueden realizar pruebas de resistencia a los medicamentos. Los últimos tres son exámenes invasivos, pero son costosos, requieren altas habilidades y tienen el potencial de causar daño a los pacientes. Por lo tanto, un método no invasivo, rápido y simultáneo para la detección de H. pylori y las pruebas de resistencia a los medicamentos es muy importante para erradicar eficientemente H. pylori en la práctica clínica . Este protocolo tiene como objetivo presentar un procedimiento específico que involucra la prueba de cuerdas en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para la detección rápida de la infección por H. pylori y la resistencia a los antibióticos. A diferencia de los cultivos bacterianos, este método permite un diagnóstico fácil, rápido y no invasivo del estado de infección por H. pylori y la resistencia a los medicamentos. Específicamente, utilizamos qPCR para detectar rea para la infección por H. pylori y mutaciones en los genes 23S rRNA y gyrA , que codifican resistencia contra claritromicina y levofloxacino, respectivamente. En comparación con las técnicas de cultivo utilizadas de forma rutinaria, este protocolo proporciona una técnica no invasiva, de bajo costo y que ahorra tiempo para detectar la infección por H. pylori y determinar su resistencia a los antibióticos mediante qPCR.
Introduction
H. pylori es una bacteria gramnegativa, en forma de espiral, altamente móvil, que vive principalmente en la región del píloro del estómago1. Es un patógeno común que infecta a casi el 50% de la población mundial2. La mayoría de las personas con infección por H. pylori no tienen manifestaciones clínicas, y la mayoría desarrolla diferentes enfermedades después de varios años de infección, incluyendo gastritis crónica, úlceras pépticas, úlceras gástricas y cáncer gástrico3. En varios estudios basados en diferentes poblaciones, se ha demostrado la eficacia de la eliminación de H. pylori para prevenir el cáncer de estómago y las lesiones precancerosas 4,5. Por lo tanto, el Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer de la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha aconsejado la erradicación de H. pylori como medida preventiva6.
El uso de métodos no invasivos para identificar la infección por H. pylori es un componente clave del tratamiento para la mayoría de los individuos con dispepsia asintomática. La prueba de aliento con urea (UBT), la prueba de antígeno fecal de H. pylori (SAT) y las pruebas serológicas son técnicas no invasivas populares. Entre estos, el UBT es el procedimiento menos intrusivo y más preciso disponible. UBT utiliza ureasa, abundantemente presente en H. pylori, para hidrolizar urea marcada isotópicamente en amoníaco y dióxido de carbono (13C o 14C). Por el contrario, el ensayo inmunocromatográfico (ICA)7 es conveniente, simple y no invasivo para el muestreo. Sin embargo, la precisión de la prueba se ve afectada por varios factores, como la calidad de la muestra de heces, la temperatura y el intervalo entre la recolección de la muestra y la prueba. Otra prueba basada en la respuesta inmune es la prueba de anticuerpos séricos contra H. pylori , que detecta anticuerpos en el suero de un paciente. Sin embargo, esta prueba no es adecuada para el análisis posterior al tratamiento, ya que los anticuerpos permanecen mucho tiempo después de que las bacterias hayan sido eliminadas8. Otro inconveniente importante es que estos métodos solo diagnostican la infección por H. pylori y no permiten pruebas de resistencia a los medicamentos para guiar el tratamiento basado en la sensibilidad.
Para los métodos de prueba invasivos, el tejido de la biopsia gástrica debe tomarse mediante endoscopia y luego someterse a histología, la prueba rápida de ureasa y el cultivo bacteriano. Estos métodos de prueba también son muy limitados debido a varios factores. Actualmente, estas técnicas se limitan a pacientes ancianos, pacientes con alto riesgo de enfermedad precancerosa o maligna y pacientes que han fracasado en la terapia de primera línea para la enfermedad por reflujo gastroesofágico o infección por H. pylori 9. En segundo lugar, debido a las características de crecimiento únicas de H. pylori, la tasa de éxito del cultivo bacteriano solo alcanza el 50%10. Por lo tanto, los métodos de detección molecular ofrecen una nueva esperanza para superar las altas demandas de los métodos de detección invasivos y guiar el tratamiento basado en la sensibilidad. Entre los métodos de detección molecular, la PCR cuantitativa ha evolucionado enormemente en los últimos años. qPCR, a diferencia de la PCR tradicional, no requiere electroforesis en gel y cuantifica con precisión el ADN/ARN en muestras mediante la adición de cebadores y sondas en la etapa de recocido. Los kits de qPCR para la detección de la infección por H. pylori y la resistencia a los medicamentos ya están disponibles comercialmente. Sin embargo, cada método tiene sus limitaciones; Por lo tanto, el diagnóstico clínico y el tratamiento de un paciente deben considerarse junto con sus síntomas, signos, antecedentes, otras pruebas de laboratorio y respuesta al tratamiento.
Actualmente, el método principal para tratar las infecciones por H. pylori es tomar antibióticos, pero últimamente, cada vez es más difícil tratar estas infecciones debido al aumento de la resistencia a los antibióticos. Posteriormente, se ha observado una disminución significativa en la eficacia del tratamiento con H. pylori a nivel mundial, lo que hace que la erradicación de H. pylori sea un importante problema de salud pública11.
La claritromicina y la levofloxacina son los dos antibióticos de amplio espectro utilizados para tratar las infecciones causadas por H. pylori, pero varios estudios han reportado una resistencia generalizada contra estos dos medicamentos en aislados de H. pylori. A2143G, A2142G y A2142C son tres de las numerosas mutaciones puntuales encontradas en el gen 2.9 kb 23S rRNA que resultan en resistencia a la claritromicina al evitar que el macrólido se una. Al mismo tiempo, los loci de mutación del gen de resistencia a levofloxacino se localizan principalmente en los seis sitios de mutación (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) del gen gyrA 12. El descubrimiento de estos mecanismos de resistencia basados en mutaciones genéticas ha llevado a un cambio gradual en la detección de H. pylori a través de estudios basados en el cultivo a pruebas moleculares.
En general, existe una necesidad clínica urgente de un método de diagnóstico no invasivo, efectivo y simultáneo para la detección de infecciones por H. pylori y resistencia a los medicamentos. Adoptamos una prueba de cuerda combinada y un método de qPCR para superar las dificultades de muestreo y lograr el objetivo de la detección simultánea de la infección por H. pylori y la resistencia a los medicamentos utilizando diferentes sondas de cebador.
Protocol
Representative Results
Discussion
La detección de H. pylori se puede realizar utilizando métodos invasivos y no invasivos13. Las técnicas invasivas comúnmente utilizadas, como la histopatología, la prueba rápida de ureasa, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el cultivo bacteriano requieren endoscopia y biopsia. Entre los procedimientos no invasivos se recomiendan pruebas serológicas, pruebas de aliento con urea y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA)14. Si bien los …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (Subvención No. SZSM201510050) y la Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (Subvención Nº 2022A1515220023). Fundación de Investigación para Talentos Avanzados del Hospital Popular Provincial de Guandong (No. KJ012021097), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81871734, 82072380, 82272423). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
