Количественная экспресс-диагностика инфекции Helicobacter pylori и устойчивости к антибиотикам на основе количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР)
Summary
В протоколе представлен неинвазивный метод экспресс-диагностики инфекций желудка Helicobacter pylori с помощью струнного теста и определения его антибиотикорезистентности к кларитромицину и левофлоксацину с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).
Abstract
Helicobacter pylori является основным патогеном человека, который заражает примерно половину населения мира и становится серьезной угрозой для здоровья из-за растущей устойчивости к антибиотикам. Он является возбудителем хронического активного гастрита, язвенной болезни и рака желудка и был классифицирован Международным агентством по изучению рака как канцероген I группы. Поэтому быстрая и точная диагностика H. pylori и определение его устойчивости к антибиотикам важны для эффективной эрадикации этого бактериального патогена. В настоящее время методы диагностики H. pylori в основном включают дыхательный тест на мочевину (UBT), тест на антиген, тест на антитела в сыворотке, гастроскопию, экспресс-тест на уреазу (RUT) и бактериальный посев. Среди них первые три метода обнаружения являются неинвазивными, что означает, что их легко проводить. Однако бактерии не могут быть извлечены с помощью этих методов; Таким образом, тестирование на лекарственную устойчивость не может быть выполнено. Последние три являются инвазивными исследованиями, но они являются дорогостоящими, требуют высоких навыков и могут нанести вред пациентам. Таким образом, неинвазивный, быстрый и одновременный метод обнаружения H. pylori и тестирования лекарственной устойчивости очень важен для эффективной эрадикации H. pylori в клинической практике. Этот протокол направлен на то, чтобы представить конкретную процедуру, включающую струнный тест в сочетании с количественной полимеразной цепной реакцией (кПЦР) для быстрого выявления инфекции H. pylori и устойчивости к антибиотикам. В отличие от бактериальных культур, этот метод позволяет легко, быстро, неинвазивно диагностировать инфекционный статус H. pylori и лекарственную устойчивость. В частности, мы использовали кПЦР для обнаружения инфекции H. pylori и мутаций в генах 23S рРНК и gyrA, которые кодируют резистентность к кларитромицину и левофлоксацину соответственно. По сравнению с обычно используемыми методами культивирования, этот протокол обеспечивает неинвазивный, недорогой и экономящий время метод выявления инфекции H. pylori и определения ее устойчивости к антибиотикам с помощью кПЦР.
Introduction
H. pylori представляет собой спиралевидную, высокоподвижную, грамотрицательную бактерию, которая в основном обитает в привратной области желудка1. Это распространенный патоген, который заражает почти 50% населения мира2. Большинство людей с инфекцией H. pylori не имеют клинических проявлений, и у большинства из них после нескольких лет инфекции развиваются различные заболевания, включая хронический гастрит, язвенную болезнь, язву желудка и рак желудка3. В нескольких исследованиях, основанных на различных популяциях, была продемонстрирована эффективность элиминации H. pylori для профилактики рака желудка и предраковых поражений 4,5. Поэтому Международное агентство по изучению рака Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рекомендовало ликвидацию H. pylori в качестве профилактической меры6.
Использование неинвазивных методов для выявления инфекции H. pylori является ключевым компонентом лечения большинства людей с бессимптомной диспепсией. Дыхательный тест на мочевину (UBT), тест на фекальный антиген H. pylori (SAT) и серологическое тестирование являются популярными неинвазивными методами. Среди них UBT является наименее навязчивой и наиболее точной доступной процедурой. UBT использует уреазу, в изобилии присутствующую в H. pylori, для гидролиза изотопно меченной мочевины в аммиак и углекислый газ (13C или 14C). Напротив, иммунохроматографический анализ (ICA)7 удобен, прост и неинвазивен для отбора проб. Однако на точность теста влияет несколько факторов, таких как качество образца стула, температура и интервал между сбором образца и тестированием. Другим тестом, основанным на иммунном ответе, является сывороточный тест на антитела к H. pylori , который обнаруживает антитела в сыворотке крови пациента. Однако этот тест не подходит для анализа после лечения, поскольку антитела остаются еще долго после того, как бактерии были очищены8. Другим серьезным недостатком является то, что эти методы только диагностируют инфекцию H. pylori и не позволяют проводить тестирование лекарственной устойчивости для лечения на основе чувствительности.
Для инвазивных методов тестирования биопсия ткани желудка должна быть взята с помощью эндоскопии, а затем подвергнута гистологии, экспресс-тесту на уреазу и бактериальному посеву. Эти методы тестирования также очень ограничены из-за нескольких факторов. В настоящее время эти методы ограничены пожилыми пациентами, пациентами с высоким риском предраковых или злокачественных заболеваний и пациентами, которые не смогли провести терапию первой линии по поводу гастроэзофагеальной рефлюксной болезни или инфекции H. pylori 9. Во-вторых, из-за уникальных характеристик роста H. pylori вероятность успеха бактериальной культуры достигает только 50%10. Таким образом, молекулярные методы обнаружения дают новую надежду на преодоление высоких требований к инвазивным методам обнаружения и руководству лечением, основанным на чувствительности. Среди молекулярных методов обнаружения количественная ПЦР в последние годы претерпела огромные изменения. кПЦР, в отличие от традиционной ПЦР, не требует гель-электрофореза и точно количественно определяет ДНК/РНК в образцах путем добавления праймеров и зондов на стадии отжига. В настоящее время коммерчески доступны наборы для ПЦР для выявления инфекции H. pylori и лекарственной устойчивости. Тем не менее, каждый метод имеет свои ограничения; Поэтому клинический диагноз и лечение пациента следует рассматривать в сочетании с его симптомами, признаками, анамнезом, другими лабораторными тестами и ответом на лечение.
В настоящее время основным методом лечения инфекций H.pylori является прием антибиотиков, но в последнее время становится все труднее лечить эти инфекции из-за роста устойчивости к антибиотикам. Впоследствии во всем мире наблюдалось значительное снижение эффективности лечения H . pylori , что сделало ликвидацию H. pylori одной из основных проблем общественного здравоохранения11.
Кларитромицин и левофлоксацин являются двумя антибиотиками широкого спектра действия, используемыми для лечения инфекций, вызванных H.pylori, но в нескольких исследованиях сообщалось о широко распространенной резистентности к этим двум препаратам в изолятах H.pylori. A2143G, A2142G и A2142C являются тремя из многочисленных точечных мутаций, обнаруженных в гене 2.9 kb 23S рРНК, которые приводят к резистентности к кларитромицину, предотвращая связывание макролида. При этом мутационные локусы гена резистентности к левофлоксацину в основном расположены в шести мутационных сайтах (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) гена gyrA 12. Открытие этих механизмов резистентности, основанных на генетических мутациях, привело к постепенному переходу к выявлению H. pylori посредством культуральных исследований к молекулярному тестированию.
В целом, существует острая клиническая потребность в неинвазивном, эффективном и одновременном методе диагностики для выявления инфекций H. pylori и лекарственной устойчивости. Мы приняли комбинированный метод струнного теста и кПЦР, чтобы преодолеть трудности отбора проб и достичь цели одновременного выявления инфекции H. pylori и лекарственной устойчивости с использованием различных праймерных зондов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обнаружение H. pylori может быть выполнено как инвазивными, так и неинвазивными методами13. Обычно используемые инвазивные методы, такие как гистопатология, экспресс-тест на уреазу, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и культивирование бактерий, требуют эндоскопии и биопсии…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Проектом медицины Саньмин в Шэньчжэне (грант No SZSM201510050) и Гуандунский фонд фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (грант No 2022A1515220023). Научно-исследовательский фонд передовых талантов Народной больницы провинции Гуандун (No KJ012021097) и Национальный фонд естественных наук Китая (81871734, 82072380, 82272423). Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
