정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기반 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 신속 진단
Summary
이 프로토콜은 스트링 테스트를 통해 헬리코박터 파일로리 위 감염의 신속한 진단을 위한 비침습적 방법을 제시하고 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용하여 클래리스로마이신 및 레보플록사신에 대한 항생제 내성을 결정합니다.
Abstract
헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)는 전 세계 인구의 약 절반을 감염시키는 주요 인간 병원체이며 항생제 내성 증가로 인해 심각한 건강 위협이 되고 있습니다. 만성 활동성 위염, 소화성 궤양 질환 및 위암의 원인균이며 국제 암 연구소에서 그룹 I 발암 물질로 분류되었습니다. 따라서 H. pylori의 신속하고 정확한 진단과 항생제 내성 측정은 이 박테리아 병원체의 효율적인 박멸에 중요합니다. 현재 헬리코박터 파일로리 진단 방법은 주로 요소 호흡 검사(UBT), 항원 검사, 혈청 항체 검사, 위내시경 검사, 신속 요소 분해 효소 검사(RUT) 및 세균 배양을 포함합니다. 그 중 처음 세 가지 검출 방법은 비침습적이므로 수행하기 쉬운 테스트입니다. 그러나 이러한 기술을 통해 박테리아를 회수할 수 없습니다. 따라서 약물 내성 검사를 수행 할 수 없습니다. 마지막 세 가지는 침습적 검사이지만 비용이 많이 들고 높은 기술이 필요하며 환자에게 피해를 줄 가능성이 있습니다. 따라서 H. pylori 검출 및 약물 내성 검사를 위한 비침습적이고 신속하며 동시적인 방법은 임상에서 H. pylori를 효율적으로 박멸하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 H. pylori 감염 및 항생제 내성의 신속한 검출을 위해 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)과 함께 스트링 테스트를 포함하는 특정 절차를 제시하는 것을 목표로 합니다. 박테리아 배양과 달리 이 방법을 사용하면 H. pylori 감염 상태 및 약물 내성을 쉽고 신속하게 비침습적으로 진단할 수 있습니다. 구체적으로, 우리는 qPCR을 사용하여 각각 클래리스로마이신 및 레보플록사신에 대한 내성을 암호화하는 23S rRNA 및 gyrA 유전자의 H. pylori 감염 및 돌연변이에 대한 rea를 검출했습니다. 일상적으로 사용되는 배양 기술과 비교하여 이 프로토콜은 qPCR을 사용하여 H. pylori 감염을 감지하고 항생제 내성을 결정하는 비침습적이고 저렴하며 시간을 절약하는 기술을 제공합니다.
Introduction
H. pylori는 나선형의 운동성이 높은 그람 음성 박테리아로 주로 위의 유문 부위에 서식합니다1. 전 세계 인구의 거의 50%를 감염시키는 흔한 병원체이다2. 헬리코박터 파일로리 감염 환자는 대부분 임상 증상이 나타나지 않으며, 감염 후 수년이 지나면 만성 위염, 소화성 궤양, 위궤양, 위암 등 다양한 질병이 발병한다3. 다양한 집단을 기반으로 한 여러 연구에서 위암 및 전암성 병변을 예방하기 위한 H. pylori 제거 효능이 입증되었습니다 4,5. 따라서 세계보건기구(WHO) 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer)는 예방책으로 헬리코박터스 파일로리(H. pylori) 박멸을 권고하고있다 6.
H. pylori 감염을 식별하기 위해 비침습적 방법을 사용하는 것은 대부분의 무증상 소화불량 환자를 위한 치료의 핵심 요소입니다. 요소 호흡 검사(UBT), H. pylori 분변 항원 검사(SAT) 및 혈청학적 검사는 널리 사용되는 비침습적 기술입니다. 이 중 UBT는 가장 방해가 되지 않고 가장 정확한 절차입니다. UBT는 H. pylori에 풍부하게 존재하는 요소분해효소를 사용하여 동위원소 표지된 요소를 암모니아와 이산화탄소(13C 또는 14C)로 가수분해합니다. 대조적으로, 면역크로마토그래피 분석법(ICA)7은 샘플링에 편리하고 간단하며 비침습적입니다. 그러나 테스트의 정확도는 대변 샘플의 품질, 온도, 샘플 수집과 테스트 사이의 간격과 같은 여러 요인의 영향을 받습니다. 면역 반응을 기반으로 한 또 다른 검사는 환자의 혈청에서 항체를 검출하는 혈청 H. pylori 항체 검사입니다. 그러나 이 검사는 박테리아가 제거된 후에도 항체가 오래 남아 있기 때문에 후처리 분석에는 적합하지 않다8. 또 다른 주요 단점은 이러한 방법이 H. pylori 감염만 진단하고 민감도 기반 치료를 안내하는 약물 내성 검사를 허용하지 않는다는 것입니다.
침습적 검사 방법의 경우 위 생검 조직을 내시경 검사로 채취한 후 조직학, 요소분해효소 신속 검사 및 세균 배양을 받아야 합니다. 이러한 테스트 방법은 여러 요인으로 인해 매우 제한적입니다. 현재 이러한 기술은 노인 환자, 전암성 또는 악성 질환의 고위험군, 위식도 역류 질환 또는 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 1차 치료에 실패한 환자로 제한되어 있다9. 둘째, H. pylori의 독특한 성장 특성으로 인해 박테리아 배양 성공률은 50%에 불과합니다.10. 따라서 분자 검출 방법은 침습적 검출 방법의 높은 요구를 극복하고 민감도 기반 치료를 안내할 수 있는 새로운 희망을 제공합니다. 분자 검출 방법 중 정량적 PCR은 최근 몇 년 동안 엄청나게 발전했습니다. qPCR은 기존 PCR과 달리 겔 전기영동이 필요하지 않으며 어닐링 단계에서 프라이머와 프로브를 추가하여 샘플의 DNA/RNA를 정확하게 정량합니다. H. pylori 감염 및 약물 내성 검출을 위한 qPCR 키트는 현재 시판되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 각 방법에는 한계가 있습니다. 따라서 환자의 임상 진단 및 치료는 증상, 징후, 병력, 기타 실험실 검사 및 치료에 대한 반응과 함께 고려되어야 합니다.
현재 H.pylori 감염을 치료하는 주요 방법은 항생제를 복용하는 것이지만 최근에는 항생제 내성이 증가함에 따라 이러한 감염을 치료하는 것이 점점 어려워지고 있습니다. 그 결과, 헬리코박터 파일로리 치료 효능의 현저한 감소가 전 세계적으로 관찰되어 헬리코박터 파일로리 박멸이 주요 공중 보건 문제가 되었다11.
클래리스로마이신과 레보플록사신은 H.pylori에 의한 감염을 치료하는 데 사용되는 두 가지 광범위한 항생제이지만 여러 연구에서 H.pylori 분리주에서 이 두 약물에 대한 광범위한 내성이 보고되었습니다 . A2143G, A2142G 및 A2142C는 마크로라이드가 결합하는 것을 방지하여 클래리스로마이신 내성을 유발하는 2.9kb 23S rRNA 유전자에서 발견되는 수많은 점 돌연변이 중 세 가지입니다. 동시에, 레보플록사신 내성 유전자의 돌연변이 유전자좌는 주로 gyrA 유전자12의 6개 돌연변이 부위(A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G)에 위치한다. 유전적 돌연변이를 기반으로 한 이러한 저항 메커니즘의 발견은 배양 기반 연구를 통해 H. pylori 의 검출을 분자 테스트로 점진적으로 전환했습니다.
전반적으로, H. pylori 감염 및 약물 내성을 검출하기 위한 비침습적이고 효과적이며 동시적인 진단 방법에 대한 긴급한 임상적 필요성이 있습니다. 우리는 샘플링의 어려움을 극복하고 다양한 프라이머 프로브를 사용하여 H. pylori 감염과 약물 내성을 동시에 검출한다는 목표를 달성하기 위해 결합된 스트링 테스트와 qPCR 방법을 채택했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
헬리코박터 파일로리 검출은 침습적 및 비침습적 방법을 모두 사용하여 수행할 수 있다13. 조직병리학, 신속한 요소분해효소 검사, 중합효소연쇄반응(PCR) 및 박테리아 배양과 같이 일반적으로 사용되는 침습적 기술에는 내시경 검사 및 생검이 필요합니다. 혈청학적 검사, 요소 호흡 검사, 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)은 비침습적 시술 중에서 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 심천의 Sanming Project of Medicine의 지원을 받았습니다(보조금 번호. SZSM201510050) 및 광동 기초 및 응용 기초 연구 재단(보조금 번호 2022A1515220023). 관동성 인민병원 선진인재연구재단(No. KJ012021097), 중국 국립 자연 과학 재단 (81871734, 82072380, 82272423). 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
