Diagnosi rapida basata sulla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) dell'infezione da Helicobacter pylori e della resistenza agli antibiotici

H. pylori è un batterio gram-negativo a forma di spirale, altamente mobile, che vive principalmente nella regione del piloro dello stomaco¹. È un agente patogeno comune che infetta quasi il 50% della popolazione mondiale². La maggior parte delle persone con infezione da H. pylori non ha manifestazioni cliniche e la maggior parte sviluppa diverse malattie dopo diversi anni di infezione, tra cui gastrite cronica, ulcere peptiche, ulcere gastriche e cancro gastrico³. In diversi studi basati su diverse popolazioni, l’efficacia dell’eliminazione di H. pylori per prevenire il cancro allo stomaco e le lesioni precancerose è stata dimostrata ^4,5. Pertanto, l’Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro dell’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha consigliato l’eradicazione di H. pylori come misura preventiva⁶.

L’uso di metodi non invasivi per identificare l’infezione da H. pylori è una componente chiave del trattamento per la maggior parte delle persone con dispepsia asintomatica. Il test del respiro dell’urea (UBT), il test dell’antigene fecale H. pylori (SAT) e il test sierologico sono tecniche non invasive popolari. Tra queste, l’UBT è la procedura meno intrusiva e più accurata disponibile. UBT utilizza l’ureasi, abbondantemente presente in H. pylori, per idrolizzare l’urea marcata isotopicamente in ammoniaca e anidride carbonica (13C o 14C). Al contrario, il saggio immunocromatografico (ICA)⁷ è conveniente, semplice e non invasivo per il campionamento. Tuttavia, l’accuratezza del test è influenzata da diversi fattori, come la qualità del campione di feci, la temperatura e l’intervallo tra la raccolta del campione e il test. Un altro test basato sulla risposta immunitaria è il test degli anticorpi sierici H. pylori , che rileva gli anticorpi nel siero di un paziente. Tuttavia, questo test non è adatto per l’analisi post-trattamento poiché gli anticorpi rimangono a lungo dopo che i batteri sono stati eliminati⁸. Un altro grande svantaggio è che questi metodi diagnosticano solo l’infezione da H. pylori e non consentono test di resistenza ai farmaci per guidare il trattamento basato sulla sensibilità.

Per i metodi di test invasivi, il tessuto bioptico gastrico deve essere prelevato mediante endoscopia e quindi sottoposto a istologia, test rapido dell’ureasi e coltura batterica. Questi metodi di test sono anche molto limitati a causa di diversi fattori. Attualmente, queste tecniche sono limitate ai pazienti anziani, ai pazienti ad alto rischio di malattia precancerosa o maligna e ai pazienti che hanno fallito la terapia di prima linea per la malattia da reflusso gastroesofageo o l’infezione da H. pylori ⁹. In secondo luogo, a causa delle caratteristiche di crescita uniche di H. pylori, il tasso di successo della coltura batterica raggiunge solo il 50%¹⁰. Pertanto, i metodi di rilevamento molecolare offrono nuove speranze per superare le elevate esigenze dei metodi di rilevamento invasivi e guidare il trattamento basato sulla sensibilità. Tra i metodi di rilevamento molecolare, la PCR quantitativa si è evoluta enormemente negli ultimi anni. La qPCR, a differenza della PCR tradizionale, non richiede elettroforesi su gel e quantifica accuratamente il DNA/RNA nei campioni aggiungendo primer e sonde nella fase di ricottura. I kit qPCR per il rilevamento dell’infezione da H. pylori e della resistenza ai farmaci sono ora disponibili in commercio. Tuttavia, ogni metodo ha i suoi limiti; Pertanto, la diagnosi clinica e il trattamento di un paziente devono essere considerati in combinazione con i sintomi, i segni, la storia, altri test di laboratorio e la risposta al trattamento.

Attualmente, il metodo principale di trattamento delle infezioni da H.pylori sta assumendo antibiotici, ma ultimamente sta diventando sempre più difficile trattare queste infezioni a causa dell’aumento della resistenza agli antibiotici. Successivamente, un calo significativo dell’efficacia del trattamento con H. pylori è stato osservato a livello globale, rendendo l’eradicazione di H. pylori un importante problema di salute pubblica¹¹.

Claritromicina e levofloxacina sono i due antibiotici ad ampio spettro usati per trattare le infezioni causate da H.pylori, ma diversi studi hanno riportato una diffusa resistenza contro questi due farmaci negli isolati di H.pylori. A2143G, A2142G e A2142C sono tre delle numerose mutazioni puntiformi trovate nel gene rRNA 2.9 kb 23S che provocano la resistenza alla claritromicina impedendo al macrolide di legarsi. Allo stesso tempo, i loci di mutazione del gene di resistenza alla levofloxacina sono localizzati principalmente nei sei siti di mutazione (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) del gene gyrA ¹². La scoperta di questi meccanismi di resistenza basati su mutazioni genetiche ha portato a un graduale spostamento nella rilevazione di H. pylori attraverso studi basati sulla cultura ai test molecolari.

Nel complesso, vi è un’urgente necessità clinica di un metodo diagnostico non invasivo, efficace e simultaneo per il rilevamento delle infezioni da H. pylori e della resistenza ai farmaci. Abbiamo adottato un test combinato di stringa e un metodo qPCR per superare le difficoltà di campionamento e raggiungere l’obiettivo della rilevazione simultanea dell’infezione da H. pylori e della resistenza ai farmaci utilizzando diverse sonde primer.