Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model (생쥐 모델에서 모낭 자극 호르몬의 생체 내 독립 효과 탐색)

다음 프로토콜은 연구 동물 사용에 관한 모든 기관 윤리 지침을 준수했으며 중국 산둥성 병원 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 수술적 조작은 깊은 마취 하에 수행되었으며, 동물들은 수술 중 어떤 단계에서도 통증을 느끼지 않았다. 1. 수술 전 준비 기구 멸균수술 전에 오토클레이브(121°C에서 15분)에서 수술 기구를 증기 멸균합니다. 일회용 봉합사와 바늘을 충분히 준비하십시오. 수술 플랫폼 설정수술 전용 방에서 수술을 실시합니다. 작업을 위해 최소 60cm x 60cm의 벤치 영역을 할당하십시오. 75% 알코올로 해당 부위의 표면을 청소하고 일회용 의료용 수건으로 덮은 다음 30분 전에 자외선으로 소독합니다(그림 1A). 동물 준비모든 동물을 온도 조절이 가능한 방(20-25°C)에 12시간 조명, 12시간 어두운 주기로 수용합니다. 수술 전 1주일 동안 8주 된 암컷 C57BL/6 마우스를 수용 시설에 적응시킵니다. 수술 전에 쥐의 무게를 잰다. 생후 9주 된 모든 암컷 마우스에게 트리브로모에탄올(280mg/kg)을 복강내 주사하여 전신 마취를 투여하여 시술 중 모든 단계에서 통증이 없는 상태를 달성합니다. 멜록시캠(2mg/kg)을 수술 약 1시간 전에 피하주사하여 통증을 완화합니다. 수술 중 각막 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오. 깨끗한 면봉을 사용하여 뒷면에 제모 로션을 바릅니다. 로션을 마우스에 3-5분 동안 그대로 둔 다음 거즈와 면봉을 사용하여 머리카락을 제거합니다. 마우스 뒷면에서 머리카락이 모두 제거될 때까지 이 단계를 반복합니다. 거즈와 면봉을 사용하여 75% 알코올로 피부를 청소하십시오. 고무 스트립이나 면봉을 사용하여 수술 플랫폼에 마우스를 고정하고(그림 1B) 요오드포 용액을 도포하여 등을 청소합니다.알림: 난소 절제술 전에 발가락 꼬집을 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 2. 난소 절제술 참고: 트리브로모에탄올은 약 30분 동안 유지하여 수술을 최대한 완료할 수 있습니다. 일회용 메스를 사용하여 허벅지 기저부에서 위쪽으로 ~1.0cm의 등쪽을 세로로 절개하여 피부와 피하 근막만 절개하고 이때 후복막이 절단되지 않도록 합니다. 절개 부위를 왼쪽으로 당기면 하얀 지방이 보입니다. 흰색 지방 패드를 따라 ~0.5cm를 잘라 미세 집게와 가위를 사용하여 복강내 공동을 노출시킵니다. 후복막을 절단한 후 마이크로 집게로 복강내 지방패드를 천천히 부드럽게 제거합니다. 즉시 적신 거즈 외부의 0.9% 멸균 식염수로 백색 지방 조직을 적십니다. 노출된 조직은 복강 밖에 있는 동안 항상 촉촉하게 유지하십시오. 분홍색 과립 물질, 즉 난소는 백색 지방 패드의 아래쪽 부분에 부착되어 있습니다(그림 2A). 난소는 가느다란 관, 즉 자궁에 연결되어 있습니다. 5-0 흡수성 봉합사를 사용하여 자궁의 난소 끝을 결찰하고 왼쪽 난소를 제거합니다(그림 2B). 난소를 제거할 때는 주변 지방 조직을 최대한 보존해야 합니다. 수술 기구와 난소 사이의 직접적인 접촉을 피하고 난소 조직의 복강 내 착상을 방지합니다. 흰색 지방 패드를 복강내 구멍에 조심스럽게 다시 놓습니다. 5-0 흡수성 봉합사로 후방 복막에 간단한 간헐적 봉합을 수행합니다(그림 2C). 봉합이 완료되면 0.9% 멸균 식염수에 적신 거즈로 출혈을 청소합니다. 피부 절개 부위를 오른쪽으로 당기고 같은 방법으로 오른쪽 난소를 제거합니다. 4-0 비흡수성 봉합사로 간헐적 봉합사를 수행하고 0.9% 멸균 식염수에 적신 거즈로 출혈을 청소합니다(그림 2D). 두 봉합사를 모두 마친 후 요오드화 용액으로 상처를 청소하십시오. 복강내 광범위 항생제를 주사합니다. 3. 수술 후 관찰 수술 후 쥐를 37°C 항온의 담요로 옮깁니다. 쥐가 자유롭게 움직일 수 있을 때까지 동물을 개별 우리에 가두십시오. 흉골 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술 후 24시간 후에 멜록시캠(2mg/kg)을 피하주사하여 통증을 완화시킵니다. 매일 쥐를 모니터링하여 수술 상처가 합병증(탈구)의 징후 없이 제대로 치유되고 있는지 확인합니다. 4. 에스트라디올 보충제 에스트라디올 발레레이트가 보충된 사료를 준비하십시오. 사료 1kg당 2.6mg의 베타-에스트라디올 17-발레레이트를 보충하여 사용하십시오. 수술 완료 후 3일이 지나면 쥐에게 에스트라디올 발레레이트를 먹입니다. 5. FSH 주입 재조합 인간 FSH 용액을 준비합니다. 재조합 인간 FSH 분말을 0.9% 멸균 식염수로 100IU/mL로 용해시켜 주입합니다. 실험 계획에 따라 마우스를 그룹화하고 2주 동안 복강 내 주사를 통해 용매 또는 다른 용량의 재조합 FSH를 투여합니다. 재조합 FSH의 생물학적 활성에 따라 폐경기 이행기 동안 여성의 혈청 FSH 수치와 동일한 마우스에서 FSH 주사량을 사용합니다.참고: 다양한 치료에 따라 난소 절제술을 받은 에스트로겐 보충 마우스는 100μL/일 용매를 투여받은 용매(NS) 그룹, 하루 15IU/kg 체중을 투여받은 저용량 FSH(L-FSH) 그룹, 하루 체중 30IU/kg을 투여받은 고용량 FSH(H-FSH) 그룹의 세 그룹으로 무작위로 나눴습니다.