Udforskning af uafhængige virkninger af follikelstimulerende hormon in vivo i en musemodel
Summary
Follikelstimulerende hormon (FSH) i forskellige ekstragonadale væv og organer er forbundet med patogenesen af flere sygdomme. Den ovariectomized og FSH-behandlede musemodel (OVF) kan bruges til at udforske FSH’s ekstragonadale handlinger.
Abstract
Under overgangen fra en reproduktiv til en ikke-reproduktiv fase (overgangsalderen) oplever mange kvinder betydelige fysiologiske og patologiske ændringer, herunder nedsat knoglemasse, øgede blodlipider og øget visceral fedme. Niveauer af follikelstimulerende hormon (FSH) stiger under overgangsalderen. Mange undersøgelser har vist, at FSH i forskellige ekstragonadale væv og organer er forbundet med patogenesen af flere sygdomme. Derfor er det særligt vigtigt at opbygge en dyremodel, der kan hjælpe med at studere de uafhængige virkninger af FSH in vivo . I denne undersøgelse blev C57BL/6 hunmus ovariektomiseret og suppleret med østradiolvalerat (OVX + E2) for at eliminere effekten af hypothalamus-hypofyse-gonadale aksen. OVX + E2-musene modtog opløsningsmiddel (N.S.) eller forskellige doser rekombinant FSH via intraperitoneal injektion for at skabe en musemodel (OVF) kendetegnet ved relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer. Således genererede vi med succes en eksperimentel musemodel til at efterligne det tidlige stadium af overgangsalderen, kendetegnet ved forhøjede serum-FSH-niveauer. OVF-modellen har fordelene ved at være stabil, billig og nem at betjene, hvilket er velegnet til undersøgelser for at udforske FSH’s ekstragonadale handlinger. Her beskriver vi detaljerede protokoller til musens OVF-model.
Introduction
Niveauerne af follikelstimulerende hormon (FSH) stiger under overgangsalderen (udtrykket menopausal overgang blev defineret i 2011 på stadier af reproduktiv aldringsworkshop (STRAW) + 10-system)1. Det er under overgangsalderen, en periode præget af stigende FSH-niveauer og relativt stabilt østrogen1, at kvinder oplever menstruationscyklusændringer og betydelige fysiologiske ændringer, der involverer forskellige celler og væv. Disse ændringer kan i alvorlig grad påvirke kvinders livskvalitet og sundhed. Undersøgelse af virkningerne af FSH kan forbedre kvinders livskvalitet og sundhed.
FSH udskilles fra gonadotropceller i den forreste hypofyse og er afgørende for at kontrollere gonadefunktion og reproduktion2. FSH’s funktion medieres gennem FSH-receptoren (FSHR), som tilhører G-proteinkoblet receptor (GPCR)3. FSHR udtrykkes generelt i gonader, nemlig æggestokken og testiklerne. Det er bevist, at FSHR udtrykkes universelt i flere ekstragonadale celler og væv, herunder lever4, hippocampus5, osteoklaster6, adipocytter7 og endotelceller8. Nye undersøgelser har afsløret ekstra gonadale virkninger af FSH og dets potentielle kliniske relevans i dyslipidæmi4, Alzheimers sygdom5, osteoporose 9,10, aterosklerose11, fedme9 og kræft12. Derfor er det særligt vigtigt at opbygge en dyremodel, der kan hjælpe med at studere de uafhængige virkninger af FSH in vivo, for at udforske FSH’s handlinger alene.
I protokollen introducerede vi proceduren for etablering af en musemodel med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer13. Musemodellen efterligner overgangsalderen ved ovariektomiseret kirurgi og suppleres derefter med østradiolvalerat og rekombinant FSH. Da de ovariektomiserede mus blev suppleret med eksogent østrogen for at opretholde lignende østrogenniveauer med de skamopererede mus, var niveauerne af endogen FSH stabile på grund af østrogenfeedback ved hypofysen. I denne tilstand kunne det kontrollere FSH-niveauerne ved at administrere eksogent FSH uden at ændre østrogenniveauerne. Således kan OVF-musemodellen udelukke indflydelsen af østrogen og observere de ekstragonadale fysiologiske og patologiske virkninger af FSH. Vi mener, at den detaljerede og visualiserede procedure er nyttig for forskere til at etablere OVF-musemodellen i deres laboratorium og anvende den til at undersøge fysiologiske og patologiske ændringer under overgangsalderen efter behov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under overgangen fra en reproduktiv til en ikke-reproduktiv fase (overgangsalderen) oplever mange kvinder betydelige fysiologiske og patologiske ændringer. Niveauer af FSH stiger under overgangsalderen1. Nye undersøgelser har afsløret, at FSH i forskellige ekstragonadale væv og organer er kritisk i patogenesen af flere sygdomme, herunder dyslipidæmi4, Alzheimers sygdom5, osteoporose 9,10, aterosklerose11, fedme9 og kræft12. Derfor er det særligt vigtigt at opbygge en dyremodel, der kan hjælpe med at studere de uafhængige virkninger af FSH in vivo. OVF-musemodellen efterligner det tidlige stadium af overgangsalderen med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer og er især velegnet til undersøgelser for at udforske FSH’s ekstragonadale handlinger.
I denne metode blev ovariektomi lavet ved hjælp af et enkelt dorsalt rygsnit, ca. 1 cm fra lårbasen og opad (figur 1B). Huden blev skåret næsten sammen med rygmusklerne ved hjælp af en skarp dissekerende saks, og bughulen blev således tilgået. Efter operationen krævede muskelsnittet ingen suturering, og hudsåret blev lukket bilateralt med en catgut sutur (figur 2). Operationen er teknisk lettere, mindre tidskrævende og mindre skadelig for hunmus sammenlignet med andre anvendte metoder.
Nogle detaljer, der skal være til stede under operationen. For det første skal alle kirurgiske procedurer holdes rene og så sterile som muligt for at reducere risikoen for postoperativ infektion. For det andet, fordi æggestokkens væv er meget skrøbeligt, kan kirurgiske instrumenter ikke kontakte æggestokkene direkte under ovariektomi for at undgå intraperitoneal implantation. For det tredje blev musene efter operationen flyttet til et konstant temperaturtæppe på 37 °C under genopretning for at forhindre postoperativ hypotermi, der førte til døden.
En tidligere undersøgelse har vist, at endogent østrogen syntetiseres i ovarie theca-celler hos præmenopausale kvinder eller fedtstromale celler i brystet hos postmenopausale kvinder og i mindre mængder i perifert væv14. Serumøstrogenet faldt kraftigt for ovariektomiserede mus, men kan ikke elimineres (figur 3B). Imidlertid påvirker endogent østrogen syntetiseret i ekstragonadale væv ikke stabiliteten af østrogenniveauer i OVF-modellen (figur 4B).
Der er nogle begrænsninger i OVF-modellen. Når den kirurgiske operation ikke er forsigtig og fører til ovarie intraperitoneal implantation, kan det føre til modelfejl. I dette tilfælde falder serumøstrogenet ikke kraftigt og svinger i forskellige stadier af østruscyklussen. Efter eksogen administration af østrogen og FSH tager det ca. 1 uge for kroppen at nå ligevægt. Patologiske ændringer af OVF-modellen, der forekommer inden for 1 uge, kan således ikke indikere virkningerne af FSH.
Afslutningsvis har OVF-modellen fordelene ved at være stabil, billig og nem at betjene. De systemiske virkninger af FSH på højt niveau kan observeres efter intraperitoneal injektion af FSH; det vil sige, at OVF-modellen er velegnet til undersøgelser, der udforsker FSH’s ekstragonadale handlinger. Imidlertid er kravene til modelkirurgi og intraperitoneale injektionsprocedurer ret høje. Hvis finansieringen er tilstrækkelig, er specifikke knockout-modeller det bedste valg.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke dyrelaboratoriet på Shandong Provincial Hospital for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC 82101645), Natural Science Foundation of Shandong Province, Kina (ZR2020QH088) og Science and Technology Support Plan for Youth Innovation of Colleges i Shandong-provinsen (2021KJ051).
Materials
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer’s disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
