Preparación de semillas de palma dura para el análisis de espectrometría de masas por imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz
Summary
Este protocolo tuvo como objetivo describir una guía detallada sobre la preparación de secciones de muestras de semillas duras con bajo contenido de agua para el análisis MALDI-IMS, manteniendo la distribución y abundancia originales de los analitos y proporcionando una señal de alta calidad y resolución espacial.
Abstract
La espectrometría de masas de imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-IMS) se aplica para identificar compuestos en sus entornos nativos. En la actualidad, MALDI-IMS se utiliza con frecuencia en análisis clínicos. Aún así, existe una excelente perspectiva para aplicar mejor esta técnica para comprender la información fisiológica de los compuestos químicos en los tejidos vegetales. Sin embargo, la preparación puede ser un desafío para muestras específicas de materiales botánicos, ya que MALDI-IMS requiere cortes delgados (12-20 μm) para la adquisición adecuada de datos y el análisis exitoso. En este sentido, previamente, desarrollamos un protocolo de preparación de muestras para obtener secciones delgadas de semillas duras de Euterpe oleracea (palma de açaí), posibilitando su mapeo molecular mediante MALDI-IMS.
Aquí, mostramos que el protocolo desarrollado es adecuado para preparar otras semillas del mismo género. Brevemente, el protocolo se basó en sumergir las semillas en agua desionizada durante 24 h, incrustar las muestras con gelatina y seccionarlas en un criostato aclimatado. A continuación, para la deposición de la matriz, se acopló una plataforma de movimiento xy a una pulverización de aguja de ionización por electrospray (ESI) utilizando una solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y metanol 1:1 (v/v) con ácido trifluoroacético al 0,1% a 30 mg/mL. Los datos de las semillas de E. precatoria y E. edulis se procesaron utilizando software para mapear sus patrones de metabolitos.
Los oligómeros de hexosa se mapearon dentro de las rebanadas de muestra para demostrar la idoneidad del protocolo para esas muestras, ya que se sabe que esas semillas contienen grandes cantidades de manano, un polímero de la manosa de hexosa. Como resultado, se identificaron picos de oligómeros de hexosa, representados por aductos [M + K]+ de (Δ = 162 Da). Por lo tanto, el protocolo de preparación de muestras, previamente desarrollado a medida para semillas de E. oleracea , también permitió el análisis MALDI-IMS de otras dos semillas de palma dura. En definitiva, el método podría constituir una herramienta valiosa para la investigación en morfoanatomía y fisiología de materiales botánicos, especialmente a partir de muestras resistentes a cortes.
Introduction
La espectrometría de masas por imágenes de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-IMS) es un método potente que permite la asignación bidimensional de biomoléculas, proporciona una investigación no dirigida de compuestos ionizables y determina su distribución espacial, especialmente en muestras biológicas 1,2. Durante dos décadas, esta técnica ha permitido la detección e identificación simultánea de lípidos, péptidos, carbohidratos, proteínas, otros metabolitos y moléculas sintéticas como fármacos terapéuticos 3,4. MALDI-IMS facilita el análisis químico en la superficie de una muestra de tejido sin extracción, purificación, separación, etiquetado o tinción de muestras biológicas. Sin embargo, para el éxito del análisis, un paso fundamental en esta técnica es la preparación de la muestra, especialmente en los tejidos vegetales, que se especializan y modifican a órganos complejos generalizados debido a la aclimatación ambiental5.
Debido a las propiedades fisicoquímicas inherentes al tejido vegetal, existe la necesidad de un protocolo adaptado para satisfacer los requisitos del análisis MALDI-IMS y preservar la forma original del tejido durante la preparación del corte 6,7. En el caso de muestras no convencionales, como semillas, los protocolos establecidos8 no son aplicables porque estos tejidos tienen paredes celulares rígidas y bajo contenido de agua, lo que puede causar fácilmente la fragmentación de la sección y conducir a la deslocalización de compuestos9.
Nuestro grupo de investigación ha publicado datos experimentales sobre mapeo molecular y un protocolo adaptado para el análisis MALDI-IMS de la semilla de açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, que es un subproducto generado en altas cantidades durante la producción de la pulpa de açaí13. La idea era desarrollar un protocolo para el mapeo in situ de diferentes metabolitos en semillas de açaí, ayudando a sugerir posibles usos para este residuo agrícola que actualmente no están siendo explorados comercialmente. Sin embargo, debido a la resistencia de la semilla de açaí, fue necesario realizar un protocolo a medida para obtener un corte adecuado de la muestra a partir del análisis MALDI-IMS.
En este contexto, la pulpa de açaí, de importancia económica, ha motivado la creciente comercialización de otros frutos de palmeras del género Euterpe con características sensoriales similares. Los dos frutos emergentes de las palmeras que se han producido a escala industrial como alternativa al açaí14,15 son E. precatoria (conocida como açaí-do-amazonas), que crece en la selva amazónica, y E. edulis (conocida como juçara), típica de la Mata Atlántica. Sin embargo, el consumo de açaí-do-amazonas y juçara conduce a la misma acumulación de semillas resistentes y no comestibles que no se aprovechan y no se han estudiado hasta ahora en cuanto a su composición química detallada.
De este modo, demostramos aquí que el protocolo previamente diseñado puede ser utilizado, con pocas adaptaciones, para analizar semillas de E. precatoria y E. edulis para su mapeo molecular por MALDI-IMS, demostrando ser una poderosa herramienta que puede ser utilizada para el análisis de la composición de estos recursos y puede ayudar a determinar sus potenciales usos biotecnológicos. Además, la descripción detallada que se proporciona aquí puede ayudar a otras personas con dificultades similares en la preparación de materiales resistentes para el análisis MALDI-IMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las plantas están compuestas de tejidos especializados para funciones bioquímicas específicas. Por lo tanto, el protocolo de preparación de muestras para MALDI-IMS debe diseñarse de acuerdo con varios tejidos vegetales con propiedades fisicoquímicas específicas, ya que las muestras deben mantener su distribución y abundancia de analitos originales para una señal de alta calidad y resolución espacial8.
Antes del análisis MALDI-IMS, la consideración principal …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto Serrapilheira (Serra-1708-15009) y la Fundación Carlos Chagas Filho de Apoyo a la Investigación en el Estado de Río de Janeiro (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). El Instituto Serrapilheira y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) otorgaron becas para el Dr. Felipe Lopes Brum y el Dr. Gabriel R. Martins (Programa de Fortalecimiento de Capacidades Institucionales/INT/MCTI). La Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Nivel Superior (CAPES) es reconocida por otorgar una beca de maestría para el Sr. Davi, M. M. C. da Silva. El Centro de Espectrometría de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) es reconocido por los servicios prestados con los análisis MALDI-IMS, y se agradece al Sr. Alan Menezes do Nascimento y al Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), financiado por la beca MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ nº 442604/2019, por el análisis de composición elemental.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
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