Подготовка твердых семян пальмы к матрично-ассистированному лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрическому анализу
Summary
Этот протокол был направлен на описание подробных рекомендаций по подготовке срезов твердых образцов семян с низким содержанием воды для анализа MALDI-IMS, поддержанию исходного распределения и содержания аналитов и обеспечению высококачественного сигнального и пространственного разрешения.
Abstract
Матричная лазерная десорбционно-ионизационная масс-спектрометрия (MALDI-IMS) применяется для идентификации соединений в их нативных средах. В настоящее время MALDI-IMS часто используется в клиническом анализе. Тем не менее, существует отличная перспектива для лучшего применения этого метода для понимания физиологической информации химических соединений в тканях растений. Тем не менее, подготовка конкретных образцов из растительных материалов может быть сложной задачей, поскольку для MALDI-IMS требуются тонкие срезы (12-20 мкм) для надлежащего сбора данных и успешного анализа. В связи с этим ранее мы разработали протокол пробоподготовки для получения тонких срезов твердых семян Euterpe oleracea (пальмы асаи), что позволило провести их молекулярное картирование с помощью MALDI-IMS.
Здесь мы показываем, что разработанный протокол подходит для подготовки других семян из того же рода. Вкратце, протокол был основан на погружении семян в деионизированную воду на 24 ч, погружении образцов с желатином и разделении их в акклиматизированном криостате. Затем, для матричного осаждения, платформа с движением xy была соединена с игольчатым распылением ионизационного распыления (ESI) с использованием раствора 1:1 (v/v) 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) и метанола с 0,1% трифторуксусной кислотой в дозе 30 мг/мл. Данные о семенах E. precatoria и E. edulis обрабатывали с помощью программного обеспечения для картирования их метаболитных паттернов.
Гексозные олигомеры были нанесены на карту в срезах образцов, чтобы доказать адекватность протокола для этих образцов, поскольку известно, что эти семена содержат большое количество маннана, полимера гексозной маннозы. В результате были выявлены пики гексозных олигомеров, представленные [M + K]+ аддуктами (Δ = 162 Da). Таким образом, протокол пробоподготовки, ранее разработанный специально для семян E. oleracea , также позволил провести анализ MALDI-IMS двух других твердых семян пальмы. Короче говоря, этот метод может стать ценным инструментом для исследований морфоанатомии и физиологии растительных материалов, особенно из устойчивых к порезам образцов.
Introduction
Матрично-ассистированная лазерная десорбционно-ионизационно-визуализирующая масс-спектрометрия (MALDI-IMS) является мощным методом, позволяющим осуществлять двумерное распределение биомолекул, обеспечивает нецелевое исследование ионизируемых соединений и определяет их пространственное распределение, особенно в биологических образцах 1,2. В течение двух десятилетий этот метод позволял одновременно обнаруживать и идентифицировать липиды, пептиды, углеводы, белки, другие метаболиты и синтетические молекулы, такие как терапевтические препараты 3,4. MALDI-IMS облегчает химический анализ поверхности образца ткани без экстракции, очистки, разделения, маркировки или окрашивания биологических образцов. Однако для успешного анализа ключевым этапом в этом методе является подготовка образцов, особенно в растительных тканях, которые специализированы и модифицированы в широко распространенные сложные органы из-заакклиматизации окружающей среды.
Из-за присущих растительным тканям физико-химических свойств существует необходимость в адаптированном протоколе, который соответствовал бы требованиям анализа MALDI-IMS и сохранял первоначальную форму ткани при подготовке к срезу 6,7. В случае нетрадиционных образцов, таких как семена, установленные протоколы8 неприменимы, поскольку эти ткани имеют жесткие клеточные стенки и низкое содержание воды, что может легко вызвать фрагментацию секции и привести к делокализации соединения9.
Наша исследовательская группа опубликовала экспериментальные данные по молекулярному картированию и адаптированный протокол для анализа MALDI-IMS семян асаи (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, которые являются побочным продуктом, образующимся в больших количествах при производстве арендуемой целлюлозы асаи 13. Идея заключалась в том, чтобы разработать протокол для картирования in situ различных метаболитов в семенах асаи, что помогло бы предложить возможные варианты использования этих сельскохозяйственных отходов, которые в настоящее время не изучаются в коммерческих целях. Однако из-за резистентности семян асаи необходимо было разработать индивидуальный протокол для получения надлежащего секционирования образцов из анализа MALDI-IMS.
В этом контексте экономически важная мякоть асаи стимулировала растущую коммерциализацию других фруктов пальм рода Эвтерпа с аналогичными органолептическими характеристиками. Два новых плода пальм, которые были произведены в промышленных масштабах в качестве альтернативы асаи14,15, – это E. precatoria (известная как açaí-do-amazonas), которая растет в засушливых районах Амазонки, и E. edulis (известная как juçara), которая типична для Атлантического леса. Тем не менее, потребление асаи-ду-амазонас и хусары приводит к такому же накоплению устойчивых и несъедобных семян, которые не используются и до сих пор не были изучены в отношении их подробного химического состава.
Таким образом, мы демонстрируем, что ранее разработанный протокол может быть использован с небольшими изменениями для анализа семян E. precatoria и E. edulis для молекулярного картирования с помощью MALDI-IMS, что является мощным инструментом, который может быть использован для анализа состава этих ресурсов и может помочь определить их потенциальное биотехнологическое использование. Кроме того, подробное описание, приведенное здесь, может помочь другим людям, испытывающим аналогичные трудности, в подготовке устойчивых материалов для анализа MALDI-IMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Растения состоят из специализированных тканей для выполнения определенных биохимических функций. Таким образом, протокол пробоподготовки для MALDI-IMS должен быть разработан в соответствии с различными растительными тканями со специфическими физико-химическими свойствами, поскольку о?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Институтом Серрапилейра (Серра-1708-15009) и Фондом поддержки исследований в штате Рио-де-Жанейро имени Карлоса Шагаса Фильо (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). Институт Серрапилхейра и Национальный совет по научно-техническому развитию (CNPq) предоставили стипендии д-ру Фелипе Лопесу Бруму и д-ру Габриэлю Р. Мартинсу (Программа наращивания институционального потенциала/INT/MCTI). Координация по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES) признана за предоставление стипендии магистра г-ну Дави М.М.К. да Силва. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) получил признание за услуги, предоставляемые в области анализа MALDI-IMS, а г-н Алан Менезес ду Насименто и Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), финансируемый грантом MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ No 442604/2019, благодарны за анализ элементарного состава.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. d. L., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d. Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
