생체분자 및 염료를 식물에 전달하기 위해 단단하거나 유연한 기판에 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이 사용
Summary
여기서는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유(VACNF)를 미세 가공하고, VACNF를 유연한 기판으로 전달하고, 생체 분자 및 염료 전달을 위해 식물에 경질 및 유연한 기판 모두에 VACNF를 적용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
생체 분자와 불침투성 염료를 온전한 식물에 전달하는 것은 중요한 과제입니다. 나노 물질은 식물에 DNA를 전달하기 위한 떠오르는 도구입니다. 이러한 새로운 도구는 흥미롭지만 아직 널리 적용되지는 않았습니다. 단단한 기판(지지대)에 제작된 나노 물질은 곡선형 식물 구조에 성공적으로 적용하기가 특히 어렵습니다. 이 연구는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이를 미세 가공하고 단단한 기판에서 유연한 기판으로 옮기는 공정을 설명합니다. 우리는 이러한 섬유(경질 또는 연질 기판)가 식물에 대한 일시적인 변형 또는 염료(예: 플루오레세인) 전달에 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하고 시연합니다. VACNF를 경질 실리콘 기판에서 연질 SU-8 에폭시 기판으로 옮겨 유연한 VACNF 어레이를 형성하는 방법을 보여줍니다. SU-8의 소수성 특성을 극복하기 위해 플렉시블 필름의 섬유는 얇은 실리콘 산화물 층(2-3nm)으로 코팅되었습니다. 구부러진 식물 장기에 전달하기 위해 이러한 섬유를 사용하기 위해 VACNF 필름의 섬유 쪽에 1μL의 염료 또는 DNA 용액 방울을 증착하고 10분 동안 기다린 다음 필름을 식물 기관에 놓고 면봉을 롤링 동작으로 사용하여 섬유를 식물 세포로 밀어 넣습니다. 이 방법을 통해 우리는 곡면이 있는 식물 기관에서 염료와 DNA 전달을 달성했습니다.
Introduction
식물 형질전환(일시적이든 안정적이든)은 아직 모든 식물 조직과 종에서 널리 달성되지 않았습니다. 식물의 일시적 형질전환은 플라스미드에 암호화된 유전자가 일시적으로 식물에 도입되지만 게놈에 안정적으로 통합되지 않는 과정입니다. 입자 충격, 아그로박테리아, 전기천공법 또는 프로토플라스트의 폴리에틸렌 글리콜 처리를 사용하는 기존 방법은 느리거나 번거로울 수 있습니다. 또한 모든 식물 종 1,2,3,4에 적용되는 것은 아닙니다. DNA 전달을 위한 나노 물질의 사용은 아직 초기 단계에 있는 급성장하는 분야입니다5. 나노 물질, 특히 탄소 나노 섬유는 상처 반응을 일으키지 않고 단백질, 덱스 트랜스 및 염료를 식물 잎에 전달하는 데 성공적으로 사용되었습니다6. 이 연구의 목표는 생체 분자 또는 염료를 식물에 전달하기 위해 한 가지 유형의 나노 물질인 탄소 나노 섬유를 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 여기서는 다양한 식물 기관에서 세포의 일시적인 변형을 가능하게 하는 생체 분자로서의 DNA에 초점을 맞춥니다.
이전에 Morgan et al.7 은 양상추, N. benthamiana 및 포플러의 잎과 애기장대의 잎과 뿌리를 일시적으로 변형시키기 위해 단단한 실리콘 기판에 부착된 탄소 나노섬유를 사용하는 것을 시연했습니다. 다양한 장기에서 형질전환이 성공적이었지만 뿌리나 열매와 같이 표면이 구부러진 식물 조직에는 섬유를 적용하기가 더 어려웠습니다. 우리는 나노 섬유에 대한 유연한 지지대가 장기의 모양에 더 잘 순응하여 전달 효율성을 향상시킬 수 있다고 추론했습니다.
여기에서는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유를 제조 및 설계하고, VACNF를 유연한 기판으로 전달하고, 생체 분자 및 염료를 전달하기 위해 식물에 경질 및 유연한 기판 모두에 VACNF를 적용하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. 탄소 나노 섬유는 Ni 촉매와 함께 직류 촉매 플라즈마 강화 화학 기상 증착 (dc C-PECVD)을 사용하여 생산되었습니다. Ni 촉매 도트의 위치, 직경 및 높이는 Melechko et al.8,9에 의해 기술된 바와 같이 전자빔 리소그래피, 금속 증발 및 리프트 오프 공정의 조합을 사용하여 제어되었습니다. 이중층 e-빔 레지스트를 사용하여, 더 두꺼운 Ni 촉매를 기판 상에 증착하여 더 긴 섬유(10)를 수득할 수 있다. 경질에서 연성 기판으로의 섬유 이동은 Fletcher et al.11에 설명된 방법의 수정을 기반으로 하며, 현재 방법은 비정질 탄소층 또는 희생 감광액층의 사용을 전제로 합니다. 섬유 이송을 통한 SU-8 리프트 오프는 SU-812,13,14의 언더베이킹 및 과소 노출로 인한 고유 인장 응력을 활용하여 달성됩니다. 복잡한 중합체인 SU-8은 자연적으로 소수성이기 때문에 DNA 전달을 촉진하는 데 사용하기가 어렵습니다. SU-8의 소수성 특성을 상쇄하기 위해 섬유가 SU-8에 내장된 후 원자층 증착15를 통해 산화규소의 얇은 층을 적용합니다. 생체 분자/염료 전달을 위해 단단한 기판에 섬유를 적용하는 것은 Davern et al.6에 설명된 핀셋 태핑의 충격력과 Morgan et al.7에 설명된 온플랜트 및 온칩 방법을 활용합니다. 유연한 VACNF 필름은 Morgan et al.7의 온칩 방법과 같이 먼저 필름에 DNA 또는 염료 방울을 반건조시킨 다음 작은 메이크업 어플리케이터(16,17)를 사용하여 곡면 식물 표면에 필름을 롤링하여 곡선형 식물 표면에 적용됩니다. 그림 1은 경질 및 연성 기판의 섬유를 식물에 적용하기 위한 다양한 접근 방식을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서 우리는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이를 구성하고, 섬유를 유연한 기판으로 옮기고, 생체분자 또는 염료를 식물에 전달하기 위해 식물에 단단하거나 유연한 기판의 섬유를 적용하는 방법을 제시했습니다. 도입된 물질의 증착을 위한 온칩(on-chip) 및 온플랜트(on-plant) 방법의 두 가지 일반적인 접근 방식을 설명했으며, VACNF 필름을 사용한 온칩 방법뿐만 아니라 경질 기판의 섬유에서 성공적인 결과를 보여주었습니다. 이러한 섬유의 적용은 전통적인 식물 변형 방법(입자 충격, PEG를 통한 원형체 변형 또는 전기천공법)보다 실제와 이론적으로 더 간단하며 Agrobacterium 매개 변형에 난치하는 식물에 사용할 수 있습니다. 그러나 소수의 셀만 변환됩니다.
수직으로 정렬된 탄소 나노 섬유는 사용자 프로그램을 통해 Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences에서 생산되었습니다. 사용자는 VACNF 생산을 위해 이 시설 사용을 신청할 수 있습니다. 대안적으로, VACNF 칩은 탄소원22,23을 갖는 직류 플라즈마 강화 화학 기상 증착 기계를 사용하여 클린룸에서 생산할 수 있습니다. 설명된 방법에는 섬유 생산, 섬유 전달 및 VACNF 칩/필름 적용에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 섬유 적용이 작동하려면 섬유가 직선이어야 하며 식물 세포에 전달되기 위해 팁에서 <200nm의 테이퍼링 직경이 있어야 합니다 6,7(그림 3). 특정 크기와 피치의 탄소 나노섬유를 만들기 위해 도트 크기, 측면 피치 및 증착된 촉매의 양을 포함하여 변경할 수 있는 다양한 매개변수가 있습니다. 탄소 나노섬유 생산에 사용할 최적의 도트 크기를 선택하기 위해 다양한 도트 크기에서 섬유를 성장시켰습니다(그림 5 참조). 300nm 직경에서 최상의 섬유가 생성된다는 것을 발견했기 때문에 이 도트 크기를 선택했습니다(그림 5). 올바른 매개변수를 찾은 후 이상적인 형상(직선 및 팁 직경 50% 있는 칩을 사용하려고 했습니다. 섬유의 형상을 확인하기 위해 주사 전자 현미경을 사용하여 VACNF 칩/필름 샘플에서 임의의 시야를 이미지화했습니다.
또한 섬유는 식물 세포 내에서 전달을 달성하기 위해 특정 최소 길이를 가져야 합니다. 길이가 다른 섬유를 생산하는 것의 중요성은 더 긴 섬유를 사용하여 더 깊은 조직층을 관통할 수 있다는 것입니다. 더 긴 섬유(길이 >40μm)는 섬유 전달이 베이스에서 섬유를 분리하여 작동하고 섬유 위에 SU-8을 레이어링해야 하기 때문에 유연한 필름에 필수적입니다. 이 프로토콜에 사용되는 SU-8 층의 작업 두께는 20-35 μm입니다. 다양한 식물의 표피 (곡선 또는 평면)에서 전달을 수행하는 데 필요한 최소 높이는 10-15 μm 6,7입니다. 결과적으로 VACNF 필름에는 길이가 >40μm인 섬유가 필요합니다. 탄소 나노 섬유를 생산할 때 고려해야 할 몇 가지 매개 변수가 있습니다 : 촉매 재료, 촉매 형상, 촉매 재료의 두께 및 PECVD 챔버 내 조건 (가스 비율, 압력, 온도, 전류, 샤워 헤드 높이 및 성장 시간) 8,9,24,25. Morgan et al.7 및 Davern et al.6에서 사용하는 25μm 이상의 탄소 나노섬유를 생산하기 위해 Ni 촉매의 양을 늘리고 아세틸렌 : 암모니아 비율을 변경하여 전류 및 성장 시간을 늘렸습니다. 또한 촉매 재료의 형상에 더 많은 관심을 기울였습니다. 키가 큰 직선 섬유를 생산하기 위해서는 증착된 촉매가 화산을 닮은 모양이 아니라 하키 퍽 모양을 가져야 했습니다(그림 4). 화산 구조는 이륙 후 포토레지스트의 잔해에서 발생합니다. 화산의 형성을 방지하기 위해, PMMA의 이중층을 사용하여 전자빔 리소그래피26 동안 언더컷을 생성하였다. 언더컷은 증착된 금속 촉매의 리프트오프를 돕습니다(그림 2). 촉매의 두꺼운 층은 키가 큰 VACNF의 성장에 중요합니다. VACNF의 형태는 Merkulova et al.24에 의해 조사되었습니다. VACNF의 수직 정렬은 Ni 촉매 팁 유형 성장과 기판에 수직인 DC 전위의 정렬에 기인합니다(그림 6). 샤워헤드는 PECVD 반응기(그림 6)의 기하학적 구조를 설명하고, 전기장(27)의 전위(27)에 대한 소스로서 기능한다.
전자빔 리소그래피로 촉매 도트 배열을 정의하기 위해 전자빔 레지스트(폴리메틸 메타크릴레이트)를 적용한 다음 e-빔을 사용하여 웨이퍼의 특정 위치와 특정 모양으로 레지스트에 작은 구멍을 만들었습니다. 원하는 직경의 구멍을 정의된 간격(피치)으로 일반 그리드에 배치하고 기판을 기계에 로드하기 전에 원하는 패턴을 지정하는 파일을 전자빔 리소그래피 도구에 로드했습니다. 섬유 높이 외에도 성공적인 섬유 전달을 위한 또 다른 중요한 매개변수는 아세톤 수조에서 보내는 시간입니다. VACNF 필름은 가장자리가 말리기 시작할 때까지 아세톤 수조에 충분히 오래 두어야 합니다. 아세톤 수조에 너무 짧은 시간 동안 방치하면 칩을 들어 올리기가 더 어렵고 파손될 수 있습니다. 칩이 오래될수록 아세톤 수조에 더 오래 남아 있어야 합니다. 아세톤 배스 후, 필름/칩을 이소프로판올과 물에 넣어 접근 아세톤을 제거하고 섬유의 보호 감광액을 제거했습니다.
스핀 코팅을 수행하기 위해 웨이퍼 또는 웨이퍼 조각을 스핀 코터의 진공 척에 놓고 스핀 코터의 테스트 기능을 사용하여 웨이퍼의 중심 위치를 확인합니다. 레지스트의 작은 웅덩이(직경 ~2.5cm)를 웨이퍼 중앙에 적용하고 회전(45초 동안 3000rpm) 스핀 코팅 전후의 섬유 이미지가 섬유 형상(높이, 방향 및 피치)의 보존을 보여주는 그림 8에 포함되어 있습니다. 섬유의 존재는 섬유의 기초에서 레지스트가 솟아오르게 하고 예상보다 두꺼운 층을 초래합니다. VACNF 성장 후 스핀 코팅은 다른 그룹에 의해 탐구되었습니다11,18.
공정에서 매우 중요한 또 다른 단계는 VACNF 칩/필름에 적절한 양의 힘이 가해지도록 하는 것입니다. 전달 메카니즘은 핀셋의 임펄스력을 통해 세포벽에 작은 구멍을 뚫거나, 단단한 기판(6,7)을 두드리거나, 유연한 기판 상에서 미니-메이크업 어플리케이터로 롤링하는 섬유에 의존한다. 섬유는 분리될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있고 결과에 영향을 미치지 않고 식물 세포에 박혀 있을 수도 있지만(6,7), 적절한 압력을 얻기 위해서는 염료 흡수 및 조직 손상에 대한 검사와 함께 연습해야 합니다. 또한 검출 가능한 발현까지의 시간은 식물 종과 전달되는 벡터 유형에 따라 다르기 때문에 VACNF 칩/필름을 사용한 DNA 전달 후 적절한 이미징 시점을 선택하는 것이 중요합니다7(그림 16).
이 방법은 식물에 광범위하게 적용할 수 있지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, VACNF 필름에 얇은 실리콘 산화물 층을 추가해도 SU-8 위에 포토레지스트 보호층이 추가되기 때문에 필름이 항상 완전히 친수성이 되는 것은 아닙니다. 이 문제가 현실화되면 더 두꺼운 실리콘 산화물 층이 VACNF에 적용될 수 있습니다. 필름이 소수성인지 친수성인지 테스트하기 위해 물에 넣을 수 있습니다. 필름이 가라앉으면 친수성이고 뜨면 소수성입니다. 또한 생산된 섬유 배치 간에 차이가 있을 수 있습니다. dc-PECVD 기계에서 섬유를 성장시킬 때 변경할 수 있는 몇 가지 매개변수가 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 것은 두 가지 다른 양의 Ni 촉매에 대한 파라미터 세트입니다. 또한, Ni 촉매의 결정 배향은 제어될 수 없으며(28 ) 일부 분지화는 필연적으로 섬유를 초래할 것이다.
이 논문에서는 경질 및 연질 기질을 모두 사용하여 식물 세포에 플루오레세인 염료와 DNA를 전달하는 방법을 입증했지만, 이 방법은 다른 생체 분자 및 유전자 변형 접근법(예: 안정적인 형질전환 계통을 생산하는 데 수년이 걸리는 사과 또는 기타 과일과 같은 식물 시스템에 대한 RNAi 침묵)에 광범위하게 적용할 수 있어야 합니다. 또한, 이러한 섬유는 유전자 편집 물질을 전달하거나 식물의 안정적인 형질전환에도 사용할 수 있습니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
나노 섬유 어레이는 과학 사용자 시설의 에너지부 사무소 (제안 ID : CNMS2019-103 및 CNMS2022-A-1182)인 나노 위상 재료 과학 센터에서 제작되었습니다. CNMS의 지원은 동료 심사 제안 시스템을 통해 수여되며 결과를 게시하려는 성공적인 지원자(http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml)에게 무료로 제공됩니다. 나노 섬유 어레이 생산에 도움을 주신 Kevin Lester와 CNMS에 감사드립니다. 실험 설계에 대한 중요한 토론을 해주신 John Caughmen 박사, Timothy McKnight 박사, Amber Webb 박사, Daryl Briggs, Travis Bee 박사에게 감사드립니다. PECVD 기계의 회로도를 설명해 주신 Adam Rondinone 박사님께 감사드립니다. 과학적인 삽화를 제공해 준 Leslie Carol에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 에너지부, 과학, 생물 및 환경 연구실, DE-SC0019104 및 미국 농무부(2021-67013-34835)의 바이오이미징 과학 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. JMM은 미국 농무부: 국립 식량 농업 연구소: 농업 및 식품 연구 이니셔티브 박사 전 펠로우십 2021-67034-35167의 지원을 받았습니다.
Materials
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
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